[发明专利]一类ICCG融合蛋白及其在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯中的应用

说明书

本发明公开了一类角质酶ICCG融合蛋白及其在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的应用；本发明提供了一类对PET具有较好降解效果的角质酶ICCG的蛋白，此融合蛋白由角质酶ICCG、连接肽和锚定肽依次相连而得，其中连接肽包括(GGGGS)₂、(GGGGS)₄、GSA或17X，锚定肽包括αSP或TA2，锚定肽融合可以有效的提高角质酶ICCG对底物的结合能力，从而提高降解PET的效率；本发明通过筛选不同的连接肽和锚定肽，获得了能够有效降解PET的融合蛋白，在利用酶法降解PET废弃物方面具有广泛的应用前景。

技术领域：

本发明涉及一类ICCG融合蛋白及其在降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是由对苯二甲酸和乙二醇合成的聚合物，因其具有良好的耐热性、可塑性、韧性等优点，而广泛用于包装，吹瓶和生产纺织产品，仅在2020年，PET的生产量就超过7000万吨，而PET产品的大量生产和广泛使用不可避免地产生了大量的消费后垃圾，给我们的生存环境及健康带来巨大威胁。

目前对PET塑料的处理方式有物理法(如填埋、焚烧)和化学法，但是这两种方法的处理成本高，并可能对环境造成二次污染，生物降解可能为PET垃圾的解聚和回收提供一种更环保的途径。在过去的十年中，各种酯水解酶，如脂肪酶、羧酸酯酶、酯酶和角质酶均显示出降解PET的潜力。然而PET是一种极难水解的聚酯，含有较高比例的芳香型对苯二甲酸酯，链的流动性较差。其玻璃态转化温度为65℃，因此温度越高，PET链的波动越剧烈，越有利于酶对PET的水解，但是大部分PET水解酶在高温下活性丧失。

2012年，利用宏基因组学方法从叶枝堆肥中分离出一种在高温下可降解PET的角质酶称为叶枝堆肥角质酶(LCC)，并且其降解PET的效率至少是其他酶的33倍，但是在65℃时，LCC对瓶级PET的解聚能力较弱，三天后降解反应即停止，转化率仅为31％，为了进一步提高LCC的降解性能，对LCC进行了氨基酸突变，结果显示突变体F243I/D238C/S283C/Y127G(ICCG)的T_m值相较于野生型LCC增加了9.8℃，并且在20小时内突变型LCC对PET塑料的酶解转化率是野生型的1.5倍，虽然氨基酸突变在一定程度上提升了LCC对PET的降解活性，但是提升程度十分有限，为了使ICCG对PET具有更高的降解能力，将对PET具有粘附性的锚定肽与ICCG融合可以促进酶对PET底物的粘附，提高降解速率。

发明内容：

本发明的目的在于提供一类可有效降解PET的酶，进而提出了一种将ICCG基因通过连接肽基因融合到锚定肽基因的N端并构建基因工程菌株(图1)，从而使表达出的ICCG的氨基酸序列的C末端融合锚定肽形成融合蛋白，所述融合蛋白包括ICCG、连接肽和锚定肽，其中的锚定肽是对PET具有粘附能力的多肽，可与PET表面结合，促进融合酶在PET表面的粘附，进而促进融合酶对PET的降解。连接肽作为功能分隔物可以防止锚定肽和ICCG结构域的直接串联对融合蛋白的性质造成不利影响，减少相互之间的折叠干扰，连接肽的长度和氨基酸组成也会影响融合蛋白的性质，因此选择合适的锚定肽和连接肽对于提高ICCG对PET的降解能力至关重要。

本发明的技术方案概括如下：

一类ICCG融合蛋白，所述融合蛋白由角质酶ICCG、连接肽和锚定肽依次相连而得；连接肽包括(GGGGS)₂、(GGGGS)₄、GSA或17X；锚定肽包括αSP或TA2。

融合蛋白包括以下几种：ICCG-(GGGGS)₂-αSP、ICCG-(GGGGS)₄-αSP、ICCG-GSA-αSP、ICCG-17X-αSP、ICCG-(GGGGS)₂-TA2、ICCG-(GGGGS)₄-TA2、ICCG-GSA-TA2、ICCG-17X-TA2。