[发明专利]一种枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及分子生物学及代谢工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用，构建方法包括如下步骤：步骤一、构建表达菌株BU12；步骤二、构建得到启动子Psubgt;D8/subgt;；步骤三、将表达菌株BU12中的级联信号分子PhrG和RapG的天然启动子替换为组成型启动子Psubgt;hag/subgt;，以构建得到BC01菌株；步骤四、将BC01菌株capB,C,A和racE的启动子中至少两种启动子替换为所述启动子Psubgt;D8/subgt;，构建得到枯草芽孢杆菌工程菌。采用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌进行发酵调控培养，最终得到聚‑γ‑谷氨酸和D型谷氨酸单体含量皆较高，为拓宽聚‑γ‑谷氨酸在药物输送材料方面的市场应用奠定了坚实的基础。

技术领域

本发明涉及分子生物学及代谢工程技术领域，尤其涉及一种枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

代谢工程改造是构建工业化细胞工厂的一种重要的合成生物学手段。微生物则是目前代谢工程改造的主要研究对象之一。枯草芽孢杆菌是目前聚-γ-谷氨酸代谢合成最常用的菌株。然而，由于聚-γ-谷氨酸分子量大、粘性强，因此该产品在枯草芽孢杆菌代谢合成初期就影响了发酵液中好氧菌体的溶氧，使菌体生长受到阻碍，最终影响了聚-γ-谷氨酸的大量合成。

通过设计和改造遗传编码组件从而实现对目标代谢通路进行优化的静态调控改造策略是目前聚-γ-谷氨酸菌株代谢工程改造的最常用的方法，主要涵盖了基因插入和敲除，单/多基因的表达水平的调谐如启动子工程以调控转录水平、核糖体结合位点(Ribosome binding site，RBS)改造以实现翻译水平调节。然而，在细胞生长过程中，由于细胞代谢物或目标代谢产物的组成和浓度会随着培养基营养物质的组成、生长环境(主要是溶解氧浓度)以及细胞生长速率的变化而发生改变，所以静态调控所获得的突变株无法感应细胞生长过程中的代谢变化从而进行自身的细胞活动调节。因此，单一地减少或增加关键蛋白的表达量可能会对细胞生长产生不可逆的副作用，尽管突变菌株相对于出发菌株具有更高水平的产物积累能力，但受到细胞生长率抑制、生长鲁棒性差、代谢紊乱等因素影响，使得目标产物的合成未达到最优化水平，且在后期放大生产过程中也可能面临众多挑战。

γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamic acid，γ-PGA)是一种天然氨基酸聚合物，由多个D-和/或L-谷氨酸单体经α-氨基和γ-羧基之间的酰胺键连接而成。由于聚谷氨酸一般具有较高的分子量(100～1000kDa)，高分子量所导致的高粘度、难以控制的流变性和难修饰等缺点，限制其工业应用。γ-PGA按照不同的谷氨酸组成单体，可以分为：γ-L-PGA、γ-D-PGA、γ-L/D-PGA。有趣的是，γ-PGA不同的立体化学组成对应不同的应用。例如，可以使用L-谷氨酸含量高的γ-PGA由于其皮肤相容性，可作为化妆品材料；D-谷氨酸含量高的γ-PGA由于其低免疫原性和较低副作用，可以用于药物输送等。因此，也有必要调整γ-PGA的立体化学组成，以满足不同应用的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种枯草芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用，以提高聚-γ-谷氨酸的生物合成能力，且其中D型谷氨酸的含量也较高。

在一种实施方式中，所述degU基因的序列如genebank ID：936751所示；所述capB基因的序列如genebank ID：936833所示；所述capC基因的序列如genebank ID：936840所示；所述capA基因的序列如genebank ID：936830所示；所述racE基因的序列如genebankID：935934所示。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168购自美国典型微生物保藏中心，保藏编号为ATCC No.27370。

基于上述目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

步骤一、将枯草芽孢杆菌群体感应系统反应调节器DegU编码基因的HTH区域第191位苯丙氨酸位点突变为丙氨酸，并克隆到BS168菌株中构建表达菌株BU12；