[发明专利]一种氨基甲酰基水解酶突变体及基因和应用

说明书

本发明公开了一种氨基甲酰基水解酶突变体及基因和应用，属于基因工程技术领域。所述突变体是将氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的氨基甲酰基水解酶第242位氨基酸由天冬酰胺突变为甘氨酸，第262位氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸。本发明提供的氨基甲酰基水解酶突变体比野生型氨基甲酰基水解酶的抗氧化性更强，在强氧化剂过氧化氢环境中的残余酶活比例为40％，而野生型氨基甲酰基水解酶的残余酶活比例为18％；将本发明提供的氨基甲酰基水解酶突变体应用于D‑对羟基苯甘氨酸的生产，能够显著提高D‑对羟基苯甘氨酸的转化效率，降低生产成本。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种氨基甲酰基水解酶突变体及基因和应用。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸是合成beta-半合成内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢羟氨苄等药物的关键手性中间体。目前，其生产方法主要有化学法拆分和生物酶法两种。化学法原理为：利用光学活性剂L型(+)与DL-型对羟基苯甘氨酸反应形成其D-型对羟基苯甘氨酸-L拆分剂复盐，然后在酸性溶液中溶解，加碱调pH＝4.0，即析出D型结晶(其过程如下所示)，拆分剂一般有酒石酸、溴化樟脑磺酸、苯磺酸等。其主要缺点为：拆分前需甲酯化，拆分后又要水解去甲氧基，步骤多，收率低，拆分收率一般仅为50％。

上世纪80年代后，由于酶法合成工艺具有环境友好及成本低廉的优势，受到越来越多生产厂家的重视。在酶法转化反应过程中，原料对羟基苯海因首先经过海因酶的开环反应和构型转换得到中间体，再在氨基甲酰基水解酶的作用下进行水解脱氨，生成对羟基苯甘氨酸，其反应原理如下所示。

人们对上述两个酶进行了大量的研究，比如Kim等人利用海因酶作用底物后产生的N-乙酰基化合物的酸碱性，设计了一种基于pH颜色变化的筛选培养基，可以较为高通量地筛选得到产海因酶活力的菌株。Hirokazu Nanba et al，(1998)以这种方法成功地从土壤中筛选到一株产氨基甲酰基水解酶的土壤杆菌Agrobacterium sp.KNK712。

然而，在以上述酶品种进行生物酶法生产过程中，我们发现氨基甲酰基水解酶的抗氧化性较差，导致酶稳定性差，不利于酶的生产、储存及实际转化。因此，本发明提供一种上述酶突变品种，提高了其抗氧化能力，大大稳定酶活力及提高实际生产中的转化效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氨基甲酰基水解酶突变体及基因和应用，通过定向进化技术对目的基因进行随机突变，并结合高通量筛选方法，获得抗氧化性提高的氨基甲酰基水解酶突变体，以解决背景技术中的问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种氨基甲酰基水解酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基甲酰基水解酶第242位氨基酸由天冬酰胺突变为甘氨酸，第262位氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸，其突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。具体序列如下。

SEQ ID NO.2：

MTRQMILAVGQQGPIARAETREQVVVRLLYMLTKAASRGANFIVFPELALTTFFPRWHFTDEAELDSFYETEMPGPVVRPLFEKAAELGIGFNLGYAELVVEGGVKRRFNTSILVDKSGKIVGKYRKIHLPGHKEYEAYRPFQHLEKRYFEPGDLGFPVY

DVDAAKMGMFICNDRRWPEAWRVMGLRGAEIICGGYNTPTHNPPVPQHDHLTSFHHLLSMQAGSYQNGAWSAAAGKVGMEENCMLLGHSCIVAPTGEIVALTTTLEDEVITAAVDLDRCRELREHIFNFKQHRQPQHYGLIAEL

SEQ ID NO.4：