[发明专利]细胞因子融合蛋白的ADA分析方法

说明书

本发明涉及生物检测分析技术领域，特别涉及细胞因子融合蛋白的ADA分析方法，通过以下步骤实现：将样品酸化处理；将酸化样品经中和后在抗原包被的酶标板上孵育，形成Drug‑ADA免疫复合物；将Drug‑ADA免疫复合物从酶标板上酸化洗脱；将洗脱物与Master‑mixture工作液孵育，形成Biotin‑Drug‑ADA‑Drug‑Sulfo复合物；将Biotin‑Drug‑ADA‑Drug‑Sulfo复合物加至MSD板上孵育；测量与MSD板结合的复合物的可检测发光信号。本发明灵敏度高，重复性更好，药物耐受性更好，为新药开发、治疗手段及免疫原性分析提供了指导意义，降低企业研发新药的风险和成本。

技术领域

本发明涉及生物检测分析技术领域，特别涉及细胞因子融合蛋白的ADA分析方法。

背景技术

免疫原性是药物研发过程中必不可少的一部分，需要在临床前和临床阶段均开展。细胞因子融合蛋白是一类分子量大的药物，具有较强的免疫原性。免疫原性除了与药物的结构有关，还与给药途径、剂量和频率有关。具有免疫原性的药物可能诱发机体产生有害的免疫反应，形成抗药抗体(ADA)。ADA会引起患者强烈的免疫反应，出现过敏、应激等，甚至危害人的生命安全。免疫原性是药物研发过程中必不可少的一部分，需要在临床前和临床阶段均开展。抗药物抗体(ADA)在样品中会有两种存在形式，即游离ADA和ADA与药物的复合物(ADA-Drug)。

目前，对于已报道ADA的检测方法常用ELISA桥接法，其主要步骤为：将 Biotin-Drug、ADA加入至药物包被的96孔酶标板中进行孵育，洗板后在板中加入SA-HRP进行孵育，洗板后加入TMB显色，最后用2N H2SO4终止反应，用酶标仪读取信号值。

专利CN202110295274.8公开了免疫复合物检测方法，采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测ADA，包括包被、洗板、封闭、洗板、加样、洗板、加HRP、洗板、显色、加终止液、读板的步骤。其实验步骤复杂，重复性差，药物耐受性差，检测范围和灵敏度都较低，不能检测到低亲和力的抗体。此外，ELISA 方法需要使用硫酸作为反应终止液，硫酸具有较强的腐蚀性，使用不当会对实验人员的安全和环境造成危害。

专利CN201810130235.0公开了一种去除抗药抗体样品中游离药物的装置和方法，该发明需要先将抗体进行纯化，再将抗体偶联至琼脂糖树脂上，形成固相载体。样品中的游离药物通过与偶联的抗体结合反应而吸附在固相载体上，从而去除ADA样品中的游离药物。实验过程需要纯化抗体和制备琼脂糖柱，实验成本高。

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一大类多功能、高活性的生物物质。细胞因子融合蛋白是现今免疫学研究的一个热点方向。它是利用基因工程技术将不同的基因或基因片段融合在一起，经过表达后可以由不同的功能细胞因子拼合在一起而形成的融合蛋白，可以优化蛋白性能，甚至产生新功能。细胞因子融合蛋白具有极高的应用价值和可观的治疗前景。因此，检测细胞因子融合蛋白ADA能够判断药物的有效性和安全性，为新药开发、治疗手段及免疫原性分析提供指导意义。

发明内容

针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种高灵敏度、重复性好、药物耐受性好、实验步骤简单安全的细胞因子融合蛋白的ADA分析方法，解决了 ELISA法。

本发明提供细胞因子融合蛋白的ADA分析方法，关键在于：包括以下步骤：

S1.将样品酸化处理；

S2.将酸化样品经中和后在抗原包被的酶标板上孵育，形成Drug-ADA免疫复合物；

S3.将Drug-ADA免疫复合物从酶标板上酸化洗脱；

S4.将洗脱物与Master-mixture工作液孵育，形成Biotin-Drug-ADA-Drug-Sulfo复合物；

S5.将Biotin-Drug-ADA-Drug-Sulfo复合物加至MSD板上孵育；