[发明专利]一种NMDAR NR1亚基、NMDAR的突变体及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 202210607540.0 | 申请日： | 2022-05-31 |
| 公开（公告）号： | CN114957445B | 公开（公告）日： | 2023-09-19 |
| 发明（设计）人： | 李科;赵子越;闫亚平;程静美;郝文斌;封雪 | 申请（专利权）人： | 陕西脉元生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/705 | 分类号： | C07K14/705;C12N15/12;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/85;C12Q1/6883;A61K38/17;A61P25/00;A61P25/08;A61P25/28 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 苏士莹 |
| 地址： | 710311 陕西省西安市高新区草堂科技产业基地秦*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 nmdar nr1 突变体 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种NMDARNR1亚基的突变体，其特征在于，所述突变体不识别抗NMDAR脑炎患者的自身抗体；
所述突变体缺失NMDARNR1亚基编码氨基酸序列的837-838位和864-937位；
所述NMDARNR1亚基的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种构建权利要求1所述突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为模板，利用864-937-F和864-937-R进行PCR扩增，得缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体；所述864-937-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述864-937-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
(2)以所述缺失864-937位氨基酸的NRI亚基突变体为模板，利用837-838-F和837-838-R进行PCR扩增，得缺失837～838位和864-937位氨基酸的NMDARNR1亚基的突变体；所述837-838-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述837-838-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的体系均以50μL计，包括：模板50ng、引物F2μL、引物R2μL、FastPfuDNAPolymerase1μL、5×FastPfubuffer10μL、2.5mMdNTP4μL、DMSO1μL和余量的无核酸酶水；
步骤(1)和步骤(2)所述PCR扩增的程序，均包括：98℃预变性2min；98℃变性15s，59℃退火15s，72℃延伸4min，33个循环；72℃再延伸8min。
4.一种构建NMDAR突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述突变体插入真核表达载体上，得NR1重组载体；
(2)将NMDAR的NR2亚基插入真核表达载体上，得NR2重组载体；
(3)将NR1重组载体和NR2重组载体共同转染真核细胞，得NMDAR突变体；
步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后顺序。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述真核表达载体相同。
6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)所述NR2亚基包括NR2a或NR2b，所述NR2a的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述NR2b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(3)所述共同转染时，所述NR1重组载体和NR2重组载体的质量比为(1:1)～(1:4)。
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