[发明专利]一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用，涉及自身抗体检测技术领域。本发明对NR1亚基的特定位点进行缺失，并由缺失了NMDARNR1亚基部分氨基酸的突变体与NMDARNR2亚基共转，从而建立了在不需要拮抗剂的情况下稳定表达NR1和NR2亚基的细胞检测系统，以检测待检样本中NMDAR自身抗体。本发明得到的所述突变体细胞可与抗NMDAR脑炎患者中的自身抗体结合，一方面建立了不需要添加拮抗剂、可稳定表达识别NMDAR自身抗体的检测体系；另一方面得到了“球状”背景低的识别NMDAR自身抗体的检测体系。

技术领域

本发明属于自身抗体检测技术领域，具体涉及一种NMDAR的NR1亚基缺失突变体、突变体细胞及构建方法和应用。

背景技术

NMDAR是配体门控的阳离子通道，在突触的传递和可塑性中起着至关重要的作用。NMDAR是由GluN1和GluN2(A-D)亚基组成的异构体，分别结合甘氨酸和谷氨酸。GluN1和其中一种GluN2结合形成具有不同药理特性的受体。GluN1单亚基不能在中枢神经系统组织中形成功能受体，需要与其他亚基结合才能在神经元细胞表面表达。

2008年，Dalmau等人提出了抗NMDAR脑炎的概念，这是一种由 NMDAR自身抗体介导的严重的、潜在致命的自身免疫性疾病。由于副肿瘤性抗NMDAR脑炎在肿瘤切除和免疫治疗后有更好的预后，因此有必要建立快速检测系统，以检测针对NMDAR抗原表位的自身抗体。一般认为，NMDA 受体是由两个NR1亚单位和两个NR2亚单位构成的异四聚体。因此，建立识别NMDAR自身抗体的检测体系，就需要建立稳定表达每个NMDA受体亚基的细胞。然而，培养基中的谷氨酸和甘氨酸激活的NMDAR Ca²⁺内流对非神经元是有毒的，当NMDAR的NR1和NR2亚基同时在非神经元细胞中过表达时，会产生细胞毒性，造成靶细胞死亡。已有学者探究出可同时过表达NMDARNR1和NR2亚基的方法，Tanaka等人通过在培养基中添加拮抗剂MK-801以保护过表达NR1和NR2亚基的HEK293细胞(Tanaka K, Kitagawa Y,Hori K,etal.Evaluation of the concordance between GluN1-GluN2 heteromer live-cell-based assay and GluN1 monomer biochip kit assay on anti-NMDAR autoantibodydetection[J].Journal of Immunological Methods, 2021,499:113150.)；Thouin等人通过在培养基中添加拮抗剂500μM ketamine以保护过表达NR1和NR2亚基的HEK293细胞(Thouin A,Gastaldi M, Woodhall M,et al.Comparison of N-methyl-D-aspartatereceptor antibody assays using live or fixed substrates[J].Journal ofNeurology,2021,268(5):1818-1826)。虽然拮抗剂的加入会改善靶细胞的死亡情况，但是拮抗剂过多会造成细胞毒性，降低过表达蛋白的表达量；过少则达不到改善细胞死亡的效果，荧光染色时“球状”信号偏多，对结果的正常判断造成干扰。

自2012年Gleichman等人发现抗NMDAR患者中的自身抗体主要识别 GluN1的N368/G369区域后，过表达NMDAR单亚基GluN1的HEK293细胞被用来检测患者样本中NMDAR自身抗体，但仍有不少学者持续比较不同方法检出情况与临床信息的一致性。欧蒙的一项研究结果是商业化的单亚基检测系统虽然特异度为99％，但其在血清和脑脊液中的检测灵敏度分别是 86％和92％，其高特异度是以降低检测的灵敏度为代价的，相对于GluN1单亚基的检测系统，NR1和NR2亚基检测系统的检出率略高。因此，有必要建立一套简单、稳定、灵敏度高的过表达NMDARNR1和NR2双亚基系统以辅助当前NMDAR脑炎患者样本中自身抗体的检测。

发明内容