[发明专利]一种猪脾转移因子的制备方法

说明书

本发明公开了一种猪脾转移因子的制备方法，1）将注射用水与绞碎后的猪脾脏混合，匀浆获得匀浆液；2）匀浆液经细胞破碎后，离心，过滤，收集透过物；3）将透过物用截留孔径分子量不同的滤膜逐级进行切向流过滤，获得所需的不同分子量范围的猪脾转移因子粗制品；4）将步骤3）中至少一种分子量范围的猪脾转移因子粗制品混合，得到猪脾转移因子初制品；5）对猪脾转移因子初制品去除病毒后，调节PH，调节渗透压，过滤除菌，获得猪脾转移因子。本发明采用逐级切向流过滤，建立了精确有效的猪脾TF分离浓缩技术、小分子纯化技术，选取截留孔径分子量不同的滤膜按照不同的工艺技术流程可按需制备出各种不同分子量猪脾转移因子。

技术领域

本发明属于生物制品领域，具体涉及一种猪脾转移因子的制备方法。

背景技术

转移因子(Transfer factor,TF)是由具有免疫活性的T淋巴细胞释放的一种细胞因子，由多肽和低聚核苷酸组成，分子量小于10千道尔顿(Kilodalton,kDa)，不含蛋白，无种属特异性、无抗原性、无毒副作用，是一种新型免疫佐剂。TF具有广泛的免疫调节活性，一方面具有非特异性，从无特定抗原刺激的供体可分离获得非特异性TF(Nonspecific TF,NTF)，NTF可通过影响受体IFN-γ、IL-2、IL-4、TLR-2、TLR-4和cAMP的表达，进而增强同种或异种受体动物的非特异性免疫力；另一方面具有特异性，从受抗原刺激的供体可分离获得特异性TF(Specific TF,STF)，STF可通过抗原特异性T淋巴细胞受体β链的一部分、肽序列和S100A9蛋白等致敏淋巴细胞的特异性免疫信息，介导激活受体的巨噬细胞和抑制性T淋巴细胞，进而将供体特异性细胞免疫功能转移给同种或异种受体动物，激发特异性免疫，其反应强度与机体二次接触同类病原所产生的免疫反应相当，如：抗乙型肝炎猪脾TF。TF对于目前抗体或者抗生素无法有效控制的传染病及免疫缺陷疾病的预防起到重要作用。

TF是具有生物学活性的分子量范围分布广泛的非均一性小分子混合物，有学者认为TF是具有约44个氨基酸长度的蛋白质，通常具有约3kDa至约5kDa的分子量，但是TF分子可能具有该范围外的分子量，并且还认为TF包括三个功能部分(诱导部分、免疫抑制部分和抗原特异性部分)，其中每个部分包括不同分子量的TF分子。也有许多学者认为TF还包括核苷部分，其可以连接蛋白分子或与其分开，该核苷部分可以提高TF诱导动物免疫系统二次免疫应答的能力，也可以是TF的诱导部分或抑制部分中的一部分。另有学者研究显示TF主要包含至少581种不同分子量的多肽、核糖、Na、Zn、K、Mg、Ca等金属元素和游离氨基酸等。

目前，关于猪脾转移因子的制备方法存在以下不足：

(1)TF是具有生物学活性的分子量小于10kDa且分子量范围分布广泛的非均一性小分子混合物，包括三个功能部分(诱导部分、免疫抑制部分和抗原特异性部分)，其中每个部分包括不同分子量的TF分子。不同分子量的TF具有不同的生物学活性，因此，TF的组份分子量不同，其生物学活性、制备质量、使用剂量、临床应用均有不同。现有TF制造技术缺乏有效的TF分离浓缩技术、小分子纯化技术，不具备不同分子量TF的制备方法，导致无法获得不同分子量组成的TF。这些限制了TF的生物学活性研究、作用机理研究及有效临床应用。

(2)TF来源于畜禽脾脏，因此畜禽病毒也可经TF传播。其中，牛病毒性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒及非洲猪瘟病毒均是严重危害我国养猪业的重要疫病。要保证猪脾TF的安全性，必须对猪脾脏加以检验选择。现有TF制造技术缺乏对猪脾脏进行严格系统的外源病毒检验，尤其是缺少对我国新发猪病非洲猪瘟病毒的检验，导致所制备猪脾TF存在较大的病毒安全风险。