[发明专利]草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建及其在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用

权利要求书

1.一种草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)ctnnb1基因过表达慢病毒载体的构建

a.以草鱼全长cDNA为模板，采用下述ctnnb1 PCR扩增引物，通过PCR反应，扩增获得ctnnb1 CDS PCR产物；其中，PCR扩增ctnnb1引物如下：

ctnnb1上游引物：

atagaagacaccgactctagaatggctacccaatctgacttgatg；

ctnnb1下游引物：

ctcaccatggtggcgaccggtcagatcggtatcaaaccaggc；

b.pLV-eGFP慢病毒表达载体通过限制性内切酶为Xba Ⅰ和Age Ⅰ进行双酶切，得到线性化的pLV-eGFP慢病毒表达载体；

c.将ctnnb1 PCR产物与线性化的pLV-eGFP慢病毒表达载体进行重组，将得到的重组产物转化进新鲜的感受态大肠杆菌细胞，即得到含目的基因的pLV-eGFP-ctnnb1慢病毒载体；

2)草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建

将上述pLV-eGFP-ctnnb1慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pSPAX2质粒和pMD2.G质粒同时共转染入人胚胎肾细胞HEK293T细胞中，在该细胞中进行病毒的包装，包装好的病毒会被分泌到细胞外的培养基中，收集培养基，将培养基离心后取得上清液，上清液经过过滤、离心浓缩后即为草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒。

2.根据权利要求1所述草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中，pLV-eGFP-ctnnb1慢病毒载体、慢病毒包装辅助载体pSPAX2质粒和pMD2.G质粒的质量比为4:3:1。

3.一种权利要求1所述方法构建的草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述鱼类为草鱼。

5.一种能够稳定过表达ctnnb1基因的重组细胞系L8824-β-catenin，其特征在于：所述重组草鱼肝细胞系L8824-β-catenin中含有能够稳定过表达草鱼ctnnb1基因；所述ctnnb1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

6.一种重组草鱼肝细胞系L8824-β-catenin的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)按2-3×10⁵细胞/孔的密度将L8824细胞接种在6孔板上，培养24小时后将原有培养基弃去，加入2.5毫升的完全培养基，并继续培养至细胞汇合达到30-50％；

2)将L8824细胞培养基更换为含有权利要求1所述方法构建的草鱼ctnnb1基因过表达慢病毒与polybrene的新鲜培养基，培养24小时后更换含有嘌呤霉素的新鲜培养基进行筛选；得到能够过表达ctnnb1基因的重组草鱼肝细胞系L8824-β-catenin。

7.一种权利要求5或6所述重组草鱼肝细胞系L8824-β-catenin在提高鱼类肝细胞糖利用能力中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述鱼类为草鱼。

9.一种权利要求4或5所述重组草鱼肝细胞系L8824-β-catenin在抵抗高浓度葡萄糖对肝细胞损伤中的应用。