[发明专利]一种高效稳定表达激活型抗体的CAR-T细胞及其用途

说明书

本发明提供一种高效稳定表达激活型抗体的CAR‑T细胞及其用途。具体而言，本发明的转基因T细胞的基因组中稳定整合了含编码嵌合抗原受体，及针对CD28的激活型抗体的核酸序列的表达框，且表达框的两端包含转座子的反向末端重复序列；其中，所述嵌合抗原受体是针对EGFR家族的嵌合抗原受体，所述针对CD28的激活型抗体为膜锚定型抗体。本发明的多能CAR‑T细胞基因组中通过转座子系统稳定整合了激活型抗体的表达框，从而在保持原有CAR‑T细胞杀伤活性的前提下，具备稳定高效表达激活型抗体的活性，使回输的细胞在肿瘤部位能快速增殖。同时，为保证该多能CAR‑T细胞治疗的安全性，本发明引入分子刹车系统，必要情况下可将回输的多能CAR‑T细胞及时清除。

本发明专利申请为申请号为CN 201610445661.4、申请日为2016年6月20日、发明名称为“一种高效稳定表达激活型抗体的CAR-T细胞及其用途”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于细胞生物学和肿瘤学领域，涉及一种高效稳定表达激活型抗体的CAR-T细胞及其用途。

背景技术

针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得令人瞩目的临床疗效。其中，免疫检查点(如CTLA4、PD1/PDL1)单抗治疗，通过原位激活患者残留的肿瘤特异性T细胞发挥作用，对多种恶性肿瘤的总体有效率达到30％，且许多患者一旦起效能长期存活；转基因CAR-T/TCR-T细胞治疗，是通过离体基因修饰的手段快速获得肿瘤特异性T细胞后，过继回输进行治疗发挥作用，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)一般由一个scFv(single-chain variable Fragment)单链抗体(抗体轻重链可变区经Linker连接构成，负责结合膜抗原)，通过铰链结构(负责形成正确构象，形成二聚体)与跨膜区、胞内信号结构(负责传递T细胞活化信号)连接构成。经CAR基因修饰的T细胞(CAR-T)被赋予识别肿瘤细胞膜抗原肽分子，启动杀伤或增殖的能力。由于CAR-T细胞识别的是表达在细胞膜上的抗原，而非与MHC分子结合后被递呈到细胞表面的抗原，因而可以绕过T细胞MHC限制性，避免由于肿瘤细胞下调或缺失MHC分子引起的免疫逃逸。

CAR的设计最早由以色列学者Eshhar和其同事于1989年提出，按其发展阶段到目前为止可分为三代。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的svFC片段，胞内激活信号由CD3ζ或FcεRIγ的ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少等缺点。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，lymphocyte-specific protein tyrosinekinase(LCK)，inducible T-cell co-stimulator(ICOS)以及DNAX-activation protein10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(activation induced celldeath,AICD)。第三代CAR受体则是在第二代CAR的基础上再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，从而产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。近年来，有部分学者提出第四代CAR受体概念，他们在第三代CAR的基础上增加了IL12、IL15等具有正向调节T细胞功能的细胞因子，进一步提高T细胞的增殖、杀伤、体内存活能力。