[发明专利]检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法

说明书

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。本发明提供了利用重组毕赤酵母高效地发酵生产β2‑微球蛋白的方法。与重组大肠杆菌表达系统相比，本发明克服了易形成包涵体、复性困难且易丧失免疫学活性等问题。甲醇作为诱导碳源促使AOX1基因的表达，从而提高了目的蛋白的表达量。增加发酵液氮源含量，采用恒流加补充尿素和分批补充蛋白胨，并用氨水控制最适pH的方法，维持适宜的碳氮比，为目的产物的合成提供所需的物质。本发明诱导时长缩短、补料速率提升，使得外源蛋白降解情况好转，相同诱导时间表达量提高。并且结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化，且操作简单、临床应用广泛。

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。

背景技术

β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11.8KDa，由99个氨基酸组成的单链球蛋白。广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。Wibell发现血中β2-微球蛋白与肌酐有明显的正相关，揭示了血、尿中β2-微球蛋白是检测肾功能的灵敏指标。相较于其他传统的肾脏功能检测指标，β2-微球蛋白在肾病初期就能被检测出来，更适合作为早期肾脏疾病的临床诊断标志物。人体内肾近曲小管对β2-微球蛋白的重吸收率达到99％以上，正常情况下β2-微球蛋白从体内的排出水平极低，一般临床检测尿样中β2-微球蛋白的参考范围是0mg/L～0.3mg/L，在血液或血浆样本中最高含量为2.4mg/L。

该β2-微球蛋白可与包被在胶乳颗粒上的羊抗人β2-微球蛋白IgG结合产生浊度，在546nm处检测反应吸光度，吸光度值与β2-微球蛋白的浓度成正相关。通过乳胶免疫比浊法对血液和尿液中β2-微球蛋白进行测定最大优点是结果相关性好，准确度高，能够准确地表征抗原浓度的变化。此外，这种方法操作简单、临床应用广泛。

β2-微球蛋白的检测分为血液和尿液检测。检测血液中β2-微球蛋白的含量可以提前发现肾小球的病变、高血压患者的肾功能前期受损情况，观察肾脏移植的排斥反应，它也是反映长期血透患者淀粉样变性的指标。检测尿液中β2-微球蛋白含量来评定肾脏功能时，首先要检测血液中β2-微球蛋白的含量，排除引起血液中β2-微球蛋白含量增高的疾病。当血液中β2-微球蛋白含量正常，但尿液中β2-微球蛋白含量增高时，可进一步判断肾小管、肾小球功能是否正常、以及进行尿路感染定位等肾功能相关疾病的诊断。推进β2-微球蛋白标准化，研制β2-微球蛋白标准物质，对肾脏疾病早期诊断、病情预判以及后期治疗均有重要意义。

现存的制备方法的缺点表现在：诱导时间较长、补料速率的低、细胞表达量低、导致产量低并且表达出的蛋白准确度较低，不能够准确地表征抗原浓度变化，易形成包涵体、而且复性困难且易丧失免疫学活性，同时操作难度大，因此临床应用范围小。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供检测慢性间质性肾炎的重组抗原的制备方法。

本发明提供了编码β2-微球蛋白的核酸，其具有如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明还提供了包括所述的核酸的质粒载体。

本发明提供了表达β2-微球蛋白的酵母，其表达如SEQ ID NO.1所示的核酸。

本发明提供的重组毕赤酵母，通过多次发酵试验，结果表明构建好的工程菌株抗原产量较高、稳定性较强。

本发明还提供了重组毕赤酵母菌株的构建方法：将质粒载体转化到酵母，所述方法具体包括扩增结束后，通过SDS-PAGE电泳筛选出我们所需要的目的条带进行回收，对获得的核酸序列进行测序分析后，对获得的正确的基因序列进行重组构建，并后期通过对获得的诸多重组工程菌进行小样测试诱导蛋白的表达，对表达量较高的工程菌继续上罐验证，最终获得重组毕赤酵母。

本发明还提供了β2-微球蛋白的制备方法，所述方法包括培养所述酵母，诱导蛋白表达。