[发明专利]一种快速检测多种黄曲霉毒素的纳米抗体及其在预制菜检测中的应用

说明书

本发明提供一种快速检测多种黄曲霉毒素的纳米抗体及其应用，所述纳米抗体靶向的是黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)等几种常见黄曲霉毒素的抗原表位。通过对比试验证明在黄曲霉毒素检测中纳米抗体比商品化的单克隆抗体更灵敏，纳米抗体与胶体金标记技术相结合，灵敏度高，检测PRV的检测限可达到10ng/mL。特异性强，交叉反应少。首次开发的胶体金试纸条实现了快速检测，将原本耗时的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测，实现了对黄曲霉毒素快速检测的初步应用。

技术领域

本发明涉及蛋白抗体及其检测领域，尤其涉及一种快速检测多种黄曲霉毒素的纳米抗体及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素是一类化学结构类似的二呋喃香豆素衍生物，目前已发现20余种，主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG1)和M1(AFM1)等。其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质。各种黄曲霉毒素主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米中。因其对人、畜肝脏的剧烈损害而名列毒性之首。它们常存在于各种动物饲料和人类食品中。用污染的饲料饲养畜禽,会导致肉、乳及其制品的污染，所以必须注意检查特别容易受黄曲霉毒素污染的食品原材料，以及用这些原材料加工的食品中的黄曲霉毒素，这些食品有花生、核桃、开心果、杏仁、桃仁和李仁、椰丝、芝麻和各种粮食。人类食用被污染的食品会导致急性中毒,引起肝脏坏死出血,慢性中毒可引起肝癌。同时用被污染的饲料饲养畜禽会使畜禽生产率降低,增重减慢，造成重大经济损失。

近年来，关于黄曲霉毒素的检测方法研究较多,大致可分为薄层层析法(TLC)、液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA)。薄层层析法虽为GB5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》中的第一检测法，但是该方法不专一，容易使样品中的其他荧光物质对其测定造成干扰。液相色谱法专一性较强，但实验过程繁琐，容易造成被测物质的损失，且所需仪器设备昂贵，降低了其推广性。酶联免疫法是当今测定黄曲霉毒素较常用的方法之一，该方法推出前国标一直使用的TLC法测定黄曲霉毒素。用TLC法测定黄曲霉毒素，步骤多，耗时长，所用试剂繁多，且只能实现半定量。在实验的操作过程中，实验员必须和毒素长时间直接接触，不适合大批量样品的检测，也无法实现快速。而ELISA法灵敏度高，分析速度快，简化了提取和纯化的步骤，整个实验仅需要2h，且可以一次测定多个样品，正是ELISA独特的优点，但由于该方法利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，因此同类分子的相似性，ELISA等免疫检测方法容易对结构相似的其他黄曲霉毒素或化学物质产生一定的交叉反应性，影响实验的准确度。

单域抗体只包含重链的可变区(VHH)，其分子量很小，可以通过分子克隆从骆驼体内分离筛选得到。单域抗体不仅具有传统抗体的特异性及反应性，并且还具有更高的稳定性、可溶性及渗透性等。然而，目前本领域尚缺乏令人满意的针对各种黄曲霉毒素的单域抗体，现有技术中虽然有针对黄曲霉毒素的多种纳米抗体，但是由于其制备方法的限制多为单一性质的抗体，无法实现一种抗体实现多种检测的效果。尤其是在实际应用中，在食品检测的过程中，检测者一般不在意污染物是黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G1(AFG1)、G2(AFG1)和M1(AFM1)中的哪一种，而是只要是黄曲霉毒素就直接一票否决。因此本领域迫切需要开发新的有效针对多种黄曲霉毒素的广谱性单域抗体，用于建立高效的检测方法，并且为研发相应的检测试剂提供试验依据及候选材料。

发明内容

针对上述现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种多种黄曲霉毒素的快速特异性检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。