[发明专利]一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法,涉及生物技术及生物治疗领域；本发明将来源于胎儿附属组织（脐带、胎盘、羊膜）或牙髓、脂肪、骨髓等组织分离培养的间充质干细胞，与由外周血分离制备的纳米微粒nPRF按一定比例混合，制成一种干细胞复合nPRF制剂；该制剂不同于成分单一的间充质干细胞制剂，它不仅保留了间充质干细胞的全部特性，又赋予增强干细胞的增殖活性和分化诱导活性。其最大优势在于nPRF纳米微粒保留富血小板纤维蛋白持久缓释生长因子的特性，有利于缓释的多种生长因子对干细胞发挥生物学作用；该制剂适用于人体组织局部注射应用，例如，面部抗衰、膝骨性关节炎等。

技术领域

本发明涉及生物技术和生物治疗的领域，特别涉及一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法。

背景技术

间充质干细胞（MSC）是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，在一定条件下可分化成多种功能的细胞。研究表明，间充质干细胞具有5大生物学作用：①替代与修复受损和死亡细胞；②激活休眠和处于抑制状态的细胞；③旁分泌作用；④免疫调控机制；⑤促进细胞间信号传导恢复；间充质干细胞不仅存在于胚胎，而且存在于成人体内，可以从脐血、脐带、胎盘、骨髓、脂肪、血液等组织中分离出相应的干细胞；通过体外分离、提纯、培养、增殖、鉴定等一系列过程，获得临床应用所需要的间充质干细胞；然后通过静脉注射或介入等方法进行回输干预，间充质干细胞移动到受损器官和组织周围，起到促进细胞修复、再生、更新的作用，应用于脊髓损伤、糖尿病、缺血性心脏疾病等传统医学方法无法医治的疾病。

富血小板纤维蛋白（PRF）是在2001年由法国科学家Choukroun等人发现，是继富血小板血浆（PRP）后第二代血小板浓缩制品，被定义为自体的白细胞和富血小板纤维生物材料；富血小板纤维蛋白（PRF）富含多种生长因子，例如PDGF、VEGF、IGF、FGF、EGF等，它们具有诱导干细胞分化及促进干细胞增殖的作用；目前，PRF已广泛应用于口腔科、颌面外科、骨科、整形外科等学科。

我们以前的研究表明，将制备出的PRF凝胶颗粒与自体脂肪颗粒和血管基质成分（含有脂肪来源干细胞）按一定比例混合，应用于自体脂肪移植术中，能够显著提高自体脂肪的成活率；提示，间充质干细胞复合PRF优于单纯应用MSCs的效果。

目前，干细胞临床转化应用研究的应用方式无论是全身应用，还是局部应用，主要是成分单一的间充质干细胞制剂。尤其是在局部应用时，成分单一的间充质干细胞制剂治疗效果欠佳。干细胞在特定组织微环境条件下的存活、增殖及分化都会受到一定程度的影响。如果在干细胞制剂中复合一定浓度的纳米微粒PRF，将会增强干细胞的存活、增殖及分化的效应。由于PRF的结构优势，使得生长因子可以相对持久的释放，比如转化生长因子，血小板衍生生长因子，表皮生长因子，类胰岛素生长因子以及血管内皮生长因子等等，而这其中多种生长因子都有促进组织生长修复的功能，更大限度地满足了临床需求。因此，本申请制作了一种人间充质干细胞复合nPRF制剂及其制备方法和用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法，以解决背景技术中描述的现有技术中成分单一的间充质干细胞制剂治疗效果欠佳的问题。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法，包括以下步骤：

1、一种人间充质干细胞复合nPRF制剂及其制备方法，其特征在于，包括以下三部分：

（1）人间充质干细胞悬浮液制备步骤：

a、原代培养：组织来源：人胎儿附属组织、儿童换牙期乳磨牙牙髓组织或成人脂肪组织；

b、传代培养：原代细胞培养成活后，当细胞长至瓶底面积85%，用0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集贴壁的成纤维样细胞，进行细胞计数，以5×10⁴/ml的传代培养；

c、干细胞鉴定：收集P2代细胞进行相关鉴定，鉴定内容包括细胞形态：倒置显微镜下观察；②流式细胞仪分析细胞表面CD分子表型；③分化诱导潜能：分别进行成骨诱导、成脂诱导及成软骨诱导实验；