[发明专利]一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法

权利要求书

1.一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法，其特征在于，包括以下三部分：

（1）人间充质干细胞悬浮液制备步骤：

a、原代培养：组织来源：人胎儿附属组织、儿童换牙期乳磨牙牙髓组织或成人脂肪组织；

b、传代培养：原代细胞培养成活后，当细胞长至瓶底面积85%，用0.25%胰蛋白酶溶液消化、收集贴壁的成纤维样细胞，进行细胞计数，以5×10⁴/ml的传代培养；

c、干细胞鉴定：收集P2代细胞进行相关鉴定，鉴定内容包括细胞形态：倒置显微镜下观察；②流式细胞仪分析细胞表面CD分子表型；③分化诱导潜能：分别进行成骨诱导、成脂诱导及成软骨诱导实验；

d、人间充质干细胞悬浮液制备：取P2-P5代人间充质干细胞，0.25%用胰蛋白酶消化、收集细胞，进行细胞计数，根据需求调整细胞密度，得到人间充质干细胞悬浮液，备用，并留样进行细胞计数、细胞活力测定、热源及无菌测试；

（2）人纳米微粒富血小板纤维蛋白（nPRF）溶液制备步骤：

a、采集：使用无菌非抗凝静脉血样采集容器采集自体肘静脉外周血10ml，备用；

b、离心：然后将无菌非抗凝静脉血样采集容器放入水平离心机中离心，离心机的转速为2500rpm，离心10min，然后取出无菌非抗凝静脉血样采集容器，并在室温下静置10-20min；

c、制备nPRF制剂：用灭菌不锈钢弯匙从无菌非抗凝静脉血样采集容器中取出富血小板纤维蛋白凝胶，放在灭菌平皿中，用灭菌眼科弯剪剪碎至1mm³大小，将富血小板纤维蛋白移入匀浆杯中，补加5ml的灭菌生理盐水；然后在超净工作台中，安装及调整可调高速匀浆机，固定好匀浆刀头和匀浆杯，然后启动可调高速匀浆机，工作转速14000rpm,并启动2min，然后，取匀浆杯，用5ml的注射器抽取匀浆杯中的上清液，该上清液中为直径为50-150nm的纳米微粒富血小板纤维蛋白，得到人纳米微粒富血小板纤维蛋白溶液，备用；

（3）人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备和应用：将人间充质干细胞悬浮液和人纳米微粒富血小板纤维蛋白溶液按照4：1或5：1体积比，在无菌条件下进行混匀，在不超过1h内，注射于人体局部皮下、关节腔及颈椎或腰椎。

2.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法，其特征在于，该人胎儿附属组织为：脐带、胎盘或羊膜。

3.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞复合nPRF制剂的制备方法，其特征在于，该原代培养的培养方法采用组织块法或消化法。