[发明专利]一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法

说明书

本发明公开了一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法，属于合成生物学领域和生物医药制备技术领域。本发明通过AmgK、GlmU、NodC、NodB的组合，构建了以乙酰氨基葡萄糖为底物单元从头合成壳寡糖的一种多酶催化体外途径；利用该酶组合与辅因子再生系统的偶联，底物磷酸化速率和聚合速率得到调控，壳寡糖聚合度可控(DP10)、分子量均一(～1000Da)。在此基础上以大肠杆菌为底盘菌，将所述酶组合中的基因整合到表达载体或基因组中进行过表达，同时过表达K‑12自身的GlmS、GlmM、GlmU，获得以单一底物(乙酰氨基葡萄糖或葡萄糖)为前体从头合成壳寡糖的全细胞，在5L发酵罐中壳聚糖产量可达23.2g/L，在1000L发酵罐体系中壳聚糖产量达到20g/L以上，展现了巨大的工业生产价值。

技术领域

本发明涉及一种从头合成壳寡糖的多酶催化体系及其全细胞生产方法，属于合成生物学领域和生物医药制备技术领域。

背景技术

壳寡糖(chitooligosaccharide或者chitosan oligomers)是由20个氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的寡聚物，属于几丁质衍生物。几丁质和壳聚糖都具有重要的生物活性，这使得它们在食品、化妆品、医药和农业工业中很受欢迎。然而，这些生物高聚物的高分子量限制了它们的潜在用途，这使得它们在中性pH下的溶解度很差。有趣的是，这种限制可以通过使用壳低聚糖来克服，β-1-4-连接的GlcNAc或GlcN的同源或异源低聚物，聚合度(DP)从2到10较低。与甲壳素和壳聚糖相比，壳寡糖具有分子量小、溶解度高、吸附能力强、生物相容性好等优点。此外，壳寡糖具有广泛的生物功能，如抗氧化剂、抗炎药、抗菌药、抗肿瘤药、抗高血压药以及益生元特性，因此在营养品、化妆品和制药领域显示出巨大潜力。

小分子量(～1000Da)壳寡糖已被证实具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等多种生物活性。壳寡糖的结构，如聚合度、脱乙酰度及乙酰基位点在寡糖链上的分布都可能影响其与特定受体的结合能力，从而影响其生物活性。传统壳寡糖规模制备中，首先采用溶解性差的高脱乙酰度壳聚糖作为底物，制备方法主要分为物理、化学、酶解法3大类。酶解法具有无污染、产物得率高、产品生物活性高等优点，克服了物理法效率低以及化学法污染环境的缺点。但是，以虾壳来源的壳聚糖为前体生产壳寡糖，仍然存在前体预处理复杂、环境不友好、以及壳聚糖水解酶活性低等缺陷，限制了规模化工业应用。

发明内容

目前的研究发现微生物中存在以乙酰氨基葡萄糖为受体和UDP-乙酰氨基葡萄糖为供体，合成几丁质寡糖的关键酶(几丁质合成酶NodC)。因此，设计特定的从头合成途径，通过多种酶混合的催化反应，直接以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为单糖底物，聚合形成壳寡糖将有望成为可能。同时，该类型的多酶催化体系可在全细胞内进行整合，是一种低成本、低污染、低能耗的壳寡糖制备技术。

本发明采用微生物资源及其数据库，挖掘了新型酶分子，开发出了均一分子量壳寡糖的多酶催化的从头合成途径(以乙酰氨基葡萄糖为底物)，实现了该新途径实现在工程菌株中的合理组装，从而为获得了以葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖为底物从头合成壳寡糖的全细胞催化体系及其生产方法。本发明的目的在于提供一种壳寡糖从头合成的催化途径、多酶催化体系、全细胞转化的工程菌及生产方法。

本发明的首先提供一种具有以乙酰氨基葡萄糖为出发单糖、从头合成均一分子量壳寡糖的多酶催化体系，所述酶催化体系主要包括N-乙酰氨基葡萄糖激酶(AmgK)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(GlmU)、几丁质合成酶(NodC)、脱乙酰基酶(NodB)。

在一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖激酶AmgK来源于Pseudomonasaeruginosa ATCC 15692；所述UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶GlmU来源于Escherichiacoli MG1655；所述几丁质合成酶NodC和脱乙酰基酶NodB来源于Azorhizobiumcaulinodans ORS 571。

在一种实施方式中，编码所述AmgK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。