[发明专利]一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法

说明书

本发明提供的一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法通过添加抗坏血酸衍生物与白细胞介素因子、肿瘤坏死因子联合顺次使用以持续、稳定的提高间充质干细胞抗炎功能，而不影响细胞增殖、免疫原性，以及后续临床应用的安全性。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法。

背景技术

目前行业内用于体外增强MSC抗炎能力的方法主要包括在培养基中添加蛋白因子共培养（例如IFN-γ、TNFα、IL-1α/β、IL-17等）和基因编辑过表达抗炎相关因子等方式，增强抗炎因子分泌以提高抗炎功能。但存在以下难于克服的缺点：1.成本高：蛋白因子生产成本较高，每毫克售价一般都在千元以上，直接影响到细胞制备成本。2. 处理效果不稳定：蛋白因子具有生物活性，保存条件苛刻效期较短，稳定性较差，单独使用容易造成MSC产品批间差异，且处理效果持续性较差。3.免疫原性提高：蛋白因子的处理时间过长会增加MSC 中MHC I和II表达，增加MSC免疫原性，进而增加了MSC移植过程的风险，此外还会影响细胞表面关键标志物的表达，如CD105下降。4. 影响增殖：蛋白因子的刺激一定程度上会影响MSC的增殖能力，促进细胞衰老。5. 安全性：基因编辑方式过程复杂，引入外源物较多，难于控制，临床应用安全性存在质疑。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法，通过添加L-抗坏血酸衍生物与白细胞介素因子、肿瘤坏死因子联合顺次使用以持续、稳定的提高间充质干细胞抗炎功能，而不影响细胞增殖、免疫原性，以及后续临床应用的安全性。

为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：

一种增强间充质干细胞免疫调节能力的方法，该方法包括如下步骤：

（1）将细胞（复苏或传代的细胞（P1代至P10代））接种于培养容器中，并向培养基中添加L-抗坏血酸衍生物进行培养；之后重复上述过程，连续传代2-3次后恢复使用不含有L-抗坏血酸衍生物的培养基继续培养；

（2）之后向培养基中添加白细胞介素因子和/或肿瘤坏死因子继续培养，细胞达到80%-90%融合时收获细胞。

进一步，所述L-抗坏血酸衍生物为L-抗坏血酸2-葡糖苷、L-抗坏血酸钠盐或L-抗坏血酸钙盐中的一种或两种以上。

进一步，所述L-抗坏血酸衍生物为L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐。

进一步，添加的L-抗坏血酸衍生物的终浓度为0.01-0.1mM。

进一步，所述白细胞介素因子为IL-1α、IL-1β、IL-6中的一种或两种以上，所述肿瘤坏死因子为TNF-β和/或TNF-α。

进一步，白细胞介素因子和肿瘤坏死因子组合使用，白细胞介素因子为IL-1β，肿瘤坏死因子为TNF-α。

进一步，白细胞介素因子的添加浓度为1-5ng/ml，肿瘤坏死因子的添加浓度为1-5ng/ml。

进一步，步骤（1）的培养条件为：37℃，5% CO₂培养箱中培养66-78小时，优选地，培养72小时；

步骤（2）在传代后培养42-54小时，优选地，培养48小时；之后再添加白细胞介素因子和/或肿瘤坏死因子继续培养18-30小时，优选地，可培养24小时。

进一步，步骤（1）的初始接种密度为4000-8000/cm²，后续每一次传代的接种密度为5000-7000/cm²。

进一步，在步骤（1）中，在每一次细胞传代之前都需要用消化酶将消化成单细胞，并制成细胞悬液。

本发明还提供了一种由上述所述的方法构建的间充质干细胞。