[发明专利]一种试剂组、试剂盒及利用其进行免疫检测的方法

权利要求书

1.一种胶乳增强免疫比浊法试剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)大粒径胶乳微球和小粒径胶乳微球分别与活化缓冲液混匀后加入活化剂进行活化；

(2)将抗待测物的抗体加入活化后的大粒径胶乳微球中，将待测样本与蛋白制备成待测物蛋白复合物后加入活化后的小粒径胶乳微球中，分别进行偶联反应；

(3)向偶联反应后的反应液中加入封闭液进行封闭，封闭后弃上清，固形物分别用缓冲液复溶并重悬，即得包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂，和，包含待测物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂；

其中，所述的胶乳微球为疏水微球，表面带有负电荷的羧基；所述的大粒径胶乳微球固体含量为5％-10％，粒径为275-310nm；所述的小粒径胶乳微球固体含量为5％-10％，粒径为70-90nm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的活化缓冲液为MES缓冲液；和/或，所述的活化剂为NHS和EDC；和/或，胶乳微球:NHS:EDC的总质量比为7:10:1；和/或，所述活化的温度为37℃，反应时间为30-60min；和/或，步骤(3)中，封闭后通过离心弃上清；

优选地，所述胶乳微球为羧基聚苯乙烯胶乳微球；和/或，所述的大粒径胶乳微球固体含量为10％，粒径为275nm；和/或，所述的小粒径胶乳微球固体含量为5％，粒径为70nm；和/或，步骤(1)中，所述MES缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为6.1；和/或，步骤(3)中，所述的离心的转速为16,000rpm，时间为40min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种；所述的待测物蛋白复合物为药物与钥孔血蓝蛋白的复合物；和/或，所述偶联反应的温度为25℃，反应时间为10-90min；优选地，所述的待测物为他克莫司、雷帕霉素或环孢霉素。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的抗体经缓冲液稀释后的浓度为0.5-5mg/mL，优选1mg/mL；和/或，所述的待测物蛋白复合物经缓冲液稀释后的浓度为20-100μg/mL，优选50μg/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的封闭液为牛血清白蛋白、甘氨酸或乙醇胺；和/或，所述封闭的温度为37℃，时间为30-60min，优选在震荡的条件下封闭，例如120rpm。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，复溶抗体偶联的大粒径胶乳微球所用的缓冲液的成分包括：

-50-100mmol/L HEPES或Tris或PBS；优选100mmol/L HEPES；

-1％NaCl；

-防腐剂：0.1％NaN₃或Procline300或硫柳汞；优选0.1％Procline300；

-保护剂：1-5％海藻糖和0.1-0.5％甘氨酸；优选2％海藻糖和0.2％甘氨酸；

pH值为7.0-8.0；优选pH值为7.4；和/或，

复溶待测物蛋白复合物偶联的小粒径胶乳微球所用的缓冲液的成分为：

-50-100mmol/L HEPES或Tri或PBS；优选50mmol/L HEPES；

-3％PEG，分子量为6,000-20,000；优选分子量为8,000；

-防腐剂：0.1％NaN₃或Procline300或硫柳汞；优选0.1％Procline300；

-保护剂：1％甘油和2％蔗糖；

pH值为6.5-8.5；优选pH值为8.0。

7.一种用于胶乳增强免疫比浊法的试剂组，其特征在于，所述的试剂组包括通过如权利要求1-6中任一项所述的方法制得的包含抗体偶联的大粒径胶乳微球的R1试剂，和，用于制备含待测物蛋白复合物偶联的小粒径胶乳微球的R2试剂的各组分。