[发明专利]一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法

说明书

本发明提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：（1）将嗜酸乳杆菌在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，至所述MRS琼脂培养基中出现直径至少为3‑5 mm的菌落；（2）培养得到的菌落接种于MRS液体培养基中进行梯度发酵培养，结束培养后再向MRS液体培养基中混合渗透压调节剂和/或酶类物质，收集，得到菌体；（3）将菌体与保护剂混合，进行静电干燥，得到嗜酸乳杆菌菌粉。本发明通过对嗜酸乳杆菌菌株及生产工艺改善，保证菌粉初始活菌数的同时降低菌粉中VBNC状态的菌体数量，提升可培养菌体活菌数数量及占比，降低了工业化生产的成本。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。

背景技术

对不可培养微生物的培养及其机制的研究一直是微生物领域的研究热点和难点。活的但非可培养(viable but non-culturable，VBNC)是指处于代谢活性非常低的状态并且不分裂、但一旦被复苏就具有存活能力并且能够变得可培养的细菌。有生理活性的细菌数，包括可培养的活菌数和VBNC状态的菌体数。VBNC生理状态广泛存在于已培养和未可培养的微生物中。

乳酸菌在一定的条件下（低温、营养物质影响、pH值变化、底物浓度影响、渗透压变化等），也可以形成VBNC的生理状态，这种状态下的乳酸菌，仍具有其生理活性，但是在普通的常规培养基上很难检测出来，因此会影响最终乳酸菌在活菌计数平板（GB4789.35）上的检测结果。

目前，有很多文献报道主要采用各种方法来诱导产生VBNC的状态，如采用物理胁迫因素和化学诱导因素两大类诱导细菌进入VBNC状态；还有就是将得到的乳酸菌菌粉采用外界干预手段对其进行复苏，但是没有提到从如何在生产乳酸菌的工艺角度上，降低或者减少VBNC菌体的数量，提升可培养的乳酸菌数量。而活菌数是目前乳酸菌菌粉的质量评价关键指标，其检测的高低，直接影响了菌粉的使用（添加量）及企业成本，而且其检测方法都是标准化的国标，不能在检测方法上进行更改。

CN109749964A提供了一种提高嗜酸乳杆菌发酵与冻干活菌数的培养基处理方法。本发明同现有技术相比，根据嗜酸乳杆菌营养需求，在添加有机豌豆蛋白粉增菌试验的基础上，减少发酵液离心、乳化、冻干后的杂质，以提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数。但该方法还是较为容易因培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生，且发酵液中渗透压及代谢产物过氧化氢过高对菌体形成VBNC的影响，发酵与冻干活菌数仍有待提高。

CN112694976A提供了一种高活菌数嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法，所述制备方法为：将嗜酸乳杆菌接种到以乳酸为碳源、酵母粉、蛋白胨和牛肝浸粉为组合氮源的高密度发酵培养基中在温度30-37℃、转速60-150 rpm、初始pH 6.2-6.5的条件下发酵10-12 h，发酵过程中用碳酸钠溶液控制pH 5.5-6.0，维持罐压0.03 Mpa；得到的发酵液离心去上清后收集菌泥，菌泥与冻干保护剂按质量比1:1-1.2混匀，真空冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌冻干菌粉。该方法通过对培养基营养成分的调整来达到提高嗜酸乳杆菌冻干菌粉的活菌数，但难以避免的仍存在培养基原因造成的VBNC状态菌体的产生、发酵速度过快造成的代谢产物抑制对菌体造成反馈影响形成VBNC状态等问题。

因此，如何更好的将乳酸菌菌粉中的可培养的活菌数提升，降低VBNC状态的菌体数量，提升菌粉的检测活菌数，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提高可培养细胞含量的嗜酸乳杆菌菌粉的制备方法。本发明所述制备方法通过将乳酸菌在MRS琼脂培养基（GB4789.35-2016）上进行划线分离培养，连续多次划线传代达到一定条件后，再进行发酵培养，采用相应的控制条件进行发酵培养，添加特定物质，收集菌体，添加保护剂进行静电干燥，得到乳酸菌菌粉。通过此方法，菌粉中可培养细胞含量能达到87%以上（例如可以是87%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%等）。