[发明专利]一种宏基因组绝对定量实验全流程的数字孪生方法

权利要求书

1.一种宏基因组绝对定量实验全流程的数字孪生方法，其特征在于，包括如下模块：

模块1：构建样本库；

设定菌群的相对定量信息，包括每种菌的名称代号、各种菌之间的比例关系和DNA序列的总数量；各种菌的比例和为1；

通过现有的微生物信息DNA库，根据各种菌之间的比例关系和DNA序列的总数量，确定整个菌群的绝对定量信息，模拟用户需要的菌群环境；

DNA序列的总数量乘以菌株的相对定量为该菌株的绝对定量，即需要从现有微生物信息DNA库中提取的菌株DNA的数量；最终将所有菌株提取完毕，生成用户需要的菌群环境，即样本库；

模块2：构建内标库；

内标库的生成有两种方式：一种是用户自定义内标，需要用户自定义输入菌群的相对定量信息和DNA序列的总数量，并且用户设定的菌株需要满足与样本库中相似度低于80％的条件；另一种是系统自动生成内标，不需要用户额外输入，系统自动根据样本库挑选相似度低于80％的菌群，生成内标库；内标库生成的总量为样本库的0.1％、1％、10％三种内标浓度供用户选择；

采用两种方式插入内标：一种是在步骤1中提取菌株DNA前插入，加入内标后一起提取，内标会和DNA一起提取，这种插入方式只在后续测序过程产生误差；第二种方式是在步骤1中提取菌株DNA后插入内标DNA，由于DNA会在提取过程中产生误差，而内标DNA没有这部分误差，此时会在提取和测序中产生两段误差；

模块3：宏基因组分析流程；

本模块分为四个步骤；

步骤1：提取样本；

在提取样本时，本模块会随机生成95％-100％之间保留两位小数的百分数，作为本次提取的回收率；样本提取后将DNA序列随机切断成长度为300bp-500bp之间的片段，随机切断后的DNA库作为待测序文库以作测序使用；

步骤2：测序；

对待测序文库中的DNA序列进行模拟测序，测序是将生物信息中的“ACGT”四种碱基转换为电子信息“ACGT”四种字母，在本步骤中，直接将步骤1中的DNA数据作为测序的结果；

采用梯度方式模拟测序误差，具体实现如下：测序长度为150bp，前100bp的误差设置为一个固定的值0.01％，随着测序的后移，误差呈梯度上升的，在最后达到峰值；梯度上升过程是非线性上升的，波动范围为0.5％-2％；

步骤3：计算；

通过下式计算微生物群落的绝对定量的归一化因子：

其中，n为插入的内标DNA总数，此项为用户输入；C_s,i为第i个内标DNA的浓度，此项在生成内标DNA库时得到；Z_s,i为第i个内标DNA的reads数，此项在生成内标DNA库时得到；L_s,i为第i个内标DNA的的碱基长度，此项为固定长度150bp，如果在提取前加入内标则是打断后的长度；

步骤4：分析对比；

归一化因子乘以未知样本DNA的Z_t/L_t，即得到未知样本DNA的浓度；Z_t、L_t分别表示样本DNAt的reads数和碱基长度，都是在测序后得到；然后用未知样本DNA的相对定量乘样本总量得到未知样本DNA的绝对定量，将结果与模块1中生成DNA库时的绝对定量进行对比，观察内标法绝对定量的精确度；

通过对比两种内标插入方式和三种内标浓度来比较内标法的效果。