[发明专利]一种通过顺序整合ALP、TYR、HRP构建三酶级联荧光免疫传感平台的方法

说明书

本发明通过顺序整合ALP、TYR和HRP构建了一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法。此平台依赖于HRP和H₂O₂可以促进多巴胺和1，5‑萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物(AFC)。通过核磁质谱表征确定了合成的AFC的分子式(C₁₈H₁₅NO₄)和结构，并基于ALP可以诱导对氨基乙基苯基磷酸盐(PAPP)的水解产生中间体酪胺，TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，构建了三酶级荧光免疫系统。利用此系统实现了对心肌钙蛋白I的高灵敏检测。这种先进的信号传导方案可以为研究多酶级联系统和构建多功能生物传感器提供一种新方法。

技术领域

本发明涉及一种通过顺序整合碱性磷酸酶、酪氨酸酶和辣根过氧化物酶用来构建三酶级联触发的荧光免疫传感器平台的方法和应用，用于灵敏和选择性地检测心肌钙蛋白，属于生物传感技术领域。

背景技术

酶级联反应可以依次进行多个酶促反应，是生物系统中信号转导和放大的重要组成部分，在生物技术中也具有广泛的应用前景。在这种反应过程中，第一种酶催化得到的产物能够直接用作第二种酶的反应底物，并且原位获得的催化产物局部浓度较高，能够降低酶中间体的无效扩散。因此，与单酶催化放大相比，酶级联放大体系展现了更高的催化效率。

目前，人们越来越关注开发具有集成多个生物催化转化的新信号生成的多级酶联传感系统。迄今为止，已开发出多种多酶级联诱导反应的方法，如比色法、电化学法、化学发光法、荧光法等。然而，大多数酶级联传感系统都是基于特定的比色法，其中碱性磷酸酶ALP和HRP是常用的诱导酶。此外，因为缺乏适合系统的新型底物，导致酶级联传感系统中的底物/产物的信号输出模式过少。例如，Yang小组开发了一种酶级联免疫测定法，通过偶联ALP和TYR，基于酶诱导的荧光和比色反应检测cTnI。Chang组报道了一种基于铜纳米粒子自组装增强荧光信号的双酶级联生物传感器，用于超灵敏检测MicroRNA153。然而，据我们所知，已报道的酶级联传感系统大多数采取双酶策略并且是在非生物环境下。但在生物系统中，酶级联反应往往需要两种以上的酶。此外，酶的底物不仅是分子内的相互作用，还包括许多物质的相互作用。因此，开发具有新信号产生机制的多级酶联传感系统是非常有必要的。

为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤构建了一个ALP-TYR-HRP三酶级联触发的荧光免疫传感平台，该检测方法兼具快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。

发明内容

本发明解决的技术问题是：为了克服现有技术的不足，提出一种基于ALP-TYR-HRP的三酶级联荧光免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测心肌钙蛋白的方法。HRP和H₂O₂可以促进多巴胺和1，5-萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物(AFC)。首先，ALP可以诱导PAPP的水解产生中间体酪胺。进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大。此外，涉及ALP的级联催化过程被整合到ELISA中(ALP用作标记酶，TYR和HRP用作信号报告酶)。

为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：碱性磷酸酶ALP以诱导对氨基乙基苯基磷酸盐PAPP的水解产生中间体酪胺，进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，HRP和H₂O₂可以促进多巴胺和1，5-萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物AFC C₁₈H₁₅NO₄；从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大，黄色荧光化合物AFC的激发波长和发射波长分别固定在490nm和550nm，并通过核磁质谱对AFC进行表征，确定了AFC的分子式和结构；AFC结构式如下：