[发明专利]一种通过顺序整合ALP、TYR、HRP构建三酶级联荧光免疫传感平台的方法

权利要求书

1.一种通过顺序整合ALP-TYR-HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：

首先，碱性磷酸酶ALP以诱导对氨基乙基苯基磷酸盐PAPP的水解产生中间体酪胺，进一步引入TYR可以催化DA的产生，进而激活HRP，HRP和H₂O₂可以促进多巴胺和1，5-萘二酚的快速原位荧光反应产生强烈的黄色荧光化合物AFC C₁₈H₁₅NO₄；从而实现ALP、TYR和HRP三种酶参与的信号放大，黄色荧光化合物AFC的激发波长和发射波长分别固定在490nm和550nm，并通过核磁质谱对AFC进行表征，确定了AFC的分子式和结构；AFC结构式如下：

2.根据权利要求1通过顺序整合ALP-TYR-HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：

预期的ALP催化PAPP中磷酸基团的裂解，诱导PAPP转化为酪胺，酪胺被TYR氧化为DA，HRP和H₂O₂的共同作用促进DA和DHA的快速原位荧光反应生成荧光化合物AFC，我们采用了紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了AFC的光学性质，DA-DHA-HRP-H₂O₂混合溶液在550nm处有一个较强的发射峰，而DA-DHA、DA-DHA-HRP、DA-DHA-H₂O₂混合物没有荧光。

3.根据权利要求1通过顺序整合ALP-TYR-HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：

为了得到AFC生成的最佳条件，我们优化了反应体系的pH值、反应时间和反应物浓度，首先，考虑到实际的分析应用，我们选择Tris-HCl缓冲液的pH值为7.4，反应体系的荧光强度在3min时可以达到稳定，DA与DHA的最佳反应时间为3min，然后，对反应物浓度的影响进行优化，随着DA、DHA和H₂O₂浓度的增大，F1/F0的值迅速增大，当DA、DHA和H₂O₂分别为400μM、30μM、60μM时，F1/F0趋于稳定，因此，DA、DHA和H₂O₂浓度的有利试验条件分别为400μM、30μM、60μM。

4.根据权利要求1通过顺序整合ALP-TYR-HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：

通过吸收光谱和荧光光谱研究了AFC的光学性质，在紫外光照射下，AFC在490nm处有一个吸收峰，且可以观察到明亮的黄色荧光，AFC的激发波长和发射波长分别固定在490nm和550nm，显示出约60nm的斯托克斯位移，通过理论计算，AFC在550nm附近的发射峰的产生，可以归因于自然跃迁轨道(NTO)所展示的最低单重态激发态(S1)的部分电荷转移特性，接着，AFC的化学结构通过¹H NMR、¹³C NMR和高分辨质谱进行了表征和确认。

5.根据权利要求1通过顺序整合ALP-TYR-HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：

AFC形成的反应机理，首先，DA在氧气的存在下被氧化为邻醌结构，邻醌结构与DHA之间进一步发生分子间1，4-Michael加成，生成中间体B，B的再芳构化形成偶联产物C，但C容易被氧化成醌D，随后通过分子内Michael加成得到呋喃中间体E，E的烯醇结构在一定条件下可以重排成酮的形式，最后，氨基和羰基发生分子内缩合反应，生成AFC，值得注意的是，大气氧的氧化剂是催化邻苯二酚氧化形成强发射荧光团AFC的先决条件。

6.根据权利要求1通过顺序整合ALP-TYR-HRP构建一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台的方法，其特征在于：

所述的在HRP和H₂O₂共同作用下，DA和DHA发生原位环化反应，产生显著的荧光信号，通过顺序整合ALP、TYR和HRP构建了一个三酶级联触发的荧光免疫传感平台。