[发明专利]用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法，该方法包括步骤：1)从脑出血早产儿的侧脑室收集血性脑脊液；2)离心收集细胞；3)用神经干细胞培养基重悬细胞并维持培养；4)3‑5天半量换液，6‑8天后消化细胞并进行传代培养；5)传代至3‑5代后，收集所述生发基质干细胞。本发明通过原代和传代培养，使患儿自体神经干细胞获得大量的扩增，之后进行冻存，在合适的时候复苏并回植入患儿脑内，可大大提高早产儿脑出血后遗症的治疗效果。用本发明的培养方法培养的生发基质干细胞扩增数量多且具有稳定的性质，可满足治患儿自体疗的需求。

技术领域

本发明涉及神经干细胞培养方法，尤其涉及一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基膜干细胞培养方法。

背景技术

新生儿脑出血与成人脑出血不一样，所有新生儿脑出血都是生发基质层这个部位引起的。新生儿脑生发基质(Germinal Matrix，GM)富含新生血管以及刚完成迁移的胶质细胞，而早产儿GM血管缺乏弹力蛋白以及粘膜肌层，在血管压力变化情况下极易破裂出血。生发基质出血(Germinal Matrix Hemorrhage，GMH)是新生儿最危重的神经系统疾病之一，发病率约为3.5‰。GMH患儿后遗症较多，包括偏瘫、失语、昏迷和发育障碍等，大多数患儿会发展成我们熟知的脑瘫这种疾病。

用神经干细胞治疗脑出血后遗症是现今的热点研究领域，近年来国内外神经干细胞移植的动物及临床实验证实其对脑损伤有一定的疗效，为神经干细胞移植治疗脑出血后遗症提供了科学依据，但神经干细胞的来源缺乏及移植后免疫系统排斥等问题限制了其治疗脑损伤的进一步研究。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种来源可靠、易体外培养、脑内易存活的自体神经干细胞及其可操作性强的培养方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明首先提供了一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法，该方法包括步骤：

1)从脑出血早产儿的侧脑室收集血性脑脊液；

2)离心收集细胞；

3)用神经干细胞培养基重悬细胞并维持培养；

4)3-5天半量换液，6-8天后消化细胞并进行传代培养；

5)传代至3-5代后，收集所述生发基质干细胞。

进一步，步骤1)可具体包括：在定位装置(如3D导航或术中超声)引导下开通侧脑室通道，将内镜灌洗系统的内镜套筒插入通道，一边灌洗血肿一边收集血性脑脊液；其中灌洗液优选为37℃的林格氏(Ringer)液。优选地，灌洗液的用量为1500-2000mL。

在一个具体的实施方案中，灌洗通道有一个进水口和一个出水口，灌洗速度调整合适，保持颅内压力稳定，一边从进水口灌洗一边从出水口收集血性脑脊液。

优选地，步骤1)在检测囟门张力的情况下进行，张力较高时轻微负压抽吸，张力下降后用灌洗液连续灌洗并收集灌洗液。

进一步，步骤2)中离心收集细胞的离心速度优选为350-400g，离心时间优选为8-12分钟。

进一步，步骤3)中所述神经干细胞培养基的基础培养基为Neurobasal，其中添加有以下成分：EGF(表皮生长因)、bFGF(碱性成细胞生长因子)、LIF(白血病抑制因子)、肝素、B27添加剂、N2添加剂、非必需氨基酸、聚-L-鸟氨酸和人胎盘层粘连蛋白。

优选地，所述非必需氨基酸包括：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

优选地，各成分添加后的含量分别为：

优选地，B27添加剂为Gibco的50×溶液，根据其说明书所述添加溶液与培养液的体积比为2％。