[发明专利]用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法

权利要求书

1.一种用于早产儿脑出血后遗症的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，包括步骤：

1)从脑出血早产儿的侧脑室收集血性脑脊液；

2)离心收集细胞；

3)用神经干细胞培养基重悬细胞并维持培养；

4)3-5天半量换液，6-8天后消化细胞并进行传代培养；

5)传代至3-5代后，收集所述生发基质干细胞。

2.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤1)具体包括：定位装置引导下开通侧脑室通道，将内镜灌洗系统的内镜套筒插入通道，一边灌洗血肿一边收集血性脑脊液。

3.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤3)中所述神经干细胞培养基的基础培养基为Neurobasal，其中添加有以下成分：EGF、bFGF、LIF、肝素、B27添加剂、N2添加剂、非必需氨基酸、聚-L-鸟氨酸和人胎盘层粘连蛋白。

4.如权利要求3所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，所述非必需氨基酸包括：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

5.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤4)所述的消化细胞并进行传代的方法为：当70％以上的生发基质干细胞的细胞球生长至200μm至400μm时，消化所述生发基质干细胞并接种至低吸附培养瓶中进行培养。

6.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，步骤5)还包括将生发基质干细胞冻存的步骤，该冻存的步骤具体为：收集原培养瓶中含生发基质干细胞的培养液，离心，弃去上清，用冻存液重悬细胞后，装入冻存管，逐步降温，最后置于液氮内冻存。

7.如权利要求1所述的自体生发基质干细胞培养方法，其特征在于，还包括将自体生发基质干细胞诱导分化为神经元或神经胶质细胞的步骤。

8.一种用于生发基质干细胞培养的培养基，其特征在于，其为含有EGF、bFGF、LIF、肝素、B27添加剂、N2添加剂、非必需氨基酸、聚-L-鸟氨酸和人胎盘层粘连蛋白的Neurobasal培养基。

9.一种用于冻存生发基质干细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液是含体积百分比8％-12％的DMSO和质量百分比1％-3％的羟乙基淀粉的Neurobasal培养基。

10.一种用于生发基质干细胞培养的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有Neurobasal培养基和各种添加剂、Accutase酶和木瓜蛋白酶，以及如权利要求9所述的冻存液，所述添加剂包括EGF、bFGF、LIF、肝素、B27添加剂、N2添加剂、非必需氨基酸、聚-L-鸟氨酸和人胎盘层粘连蛋白，所述非必需氨基酸包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。