[发明专利]一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法

说明书

本发明公开了一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，所述有机酸分别为ɑ‑酮戊二酸、琥珀酸、4‑甲基‑2‑氧戊酸和2‑氧代‑3‑甲基丁酸；包括以下步骤：(1)分别用空白基质稀释相同浓度的混标储备液R0得到不同浓度的标准品储备液和高中低三种浓度的质控品溶液；(2)对样本溶液的处理；(3)有机酸的测定。本发明采用非衍生化的方法进行检测，极大的简化了前处理方式；采用简单的外标法定量检测有机酸浓度：避免使用昂贵的内标物，采用简单的外标法定量，极大程度地降低了检测成本；另外，标准曲线可被重复被使用，提高检测的效率。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法。

背景技术

有机酸是指一些具有酸性的有机化合物，是身体代谢产生的一大类化合物。它们来自膳食蛋白质，脂肪和碳水化合物，大部分有机酸直接参与生物化学反应，有机酸被身体用于产生细胞能量并提供细胞功能所需的营养。同时，有机酸具有抑菌、消炎、抗病毒、抗突变、抗癌等作用，有的能够增加灌装动脉血流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、软化血管、促进钙和铁的吸收，有的具有帮助胃消化脂肪和蛋白质；有的则具有预防疾病和促进新城代谢的作用，从而有益于人体的健康。同时细胞中有机酸的含量或比率可以作为评估身体健康状况的一个重要指标。

肺癌是癌症相关死亡的主要原因之一，肺癌细胞从肺部原发性肿瘤转移到远端器官是其高死亡率的主要驱动因素。肺癌往往在疾病的晚期被诊断出来，使得手术治疗的方法变得不可行。晚期诊断和转移在患者生存中起了关键作用，并创造了对可以预防肺癌转移的治疗的巨大需求。了解转移性肿瘤的分子谱是研究此关键途径的第一步。其中氨基酸代谢在肿瘤发生和转移中起关键作用。有机酸代谢也与肿瘤细胞分化有关。有研究表明细胞中ɑ-酮戊二酸与琥珀酸的比率与染色质修饰和肿瘤细胞分化有关，与正常细胞相比，转移性癌细胞中ɑ-酮戊二酸与琥珀酸的比率降低，表明细胞中有机酸的含量或比率与人体健康息息相关。因此，建立用于定性和定量分析人体体液，组织和细胞中的三羧酸循环(TCA)中间体α-酮戊二酸、琥铂酸、4-甲基-2-氧戊酸和2-氧代-3-甲基丁酸的方法至关重要。

目前针对细胞裂解液中有机酸浓度检测的方法主要为超高效液相-串联质谱法或气相色谱-串联质谱法，文献报道较多的是通过加入衍生试剂对有机酸进行衍生化来进行检测，比如中国专利申请CN103698449A公开了“气相色谱-质谱检测细胞内外液中有机酸的方法”，该方法利用气相色谱通过衍生化方法对细胞发酵液中有机酸进行检测，检测过程繁琐且成本高。专利申请CN110573478A公开了“检测和量化有机酸代谢产物的质谱测定方法”，该方法中一种或多种分析物在电离之前被衍生化，前处理过程复杂，且运行时间长，增加了检测成本。由于细胞内各成分含量复杂多样，简单、准确和快速定性定量细胞中有机酸很关键。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，所述4种有机酸的中英文名称及结构式如下表：

本发明通过以下方案实现：

(1)通过制备相同浓度的混标储备液R0，用空白基质稀释得到标准品储备液和高中低三种浓度的质控品溶液；

标准品溶液的制备：称取对应4种有机酸的标准品，分别用甲醇配制为浓度相同的标准品母液，分别取标准品母液混合得到相同浓度的混标储备液R0，将混标储备液R0用空白基质稀释得到标准品储备液W1，将标准品储备液W1用空白基质逐级稀释得到另外8个浓度点的标准品储备液W2-W9；混标储备液及标准品储备液的浓度如下表：

质控品溶液的制备：分别取20μL，120μL，320μL标准品储备液W1，用空白基质定容至400μL，混匀，分别得到低中高三个质控品。