[发明专利]一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法

权利要求书

1.一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，所述4种有机酸分别为α-酮戊二酸、琥珀酸、4-甲基-2-氧戊酸和2-氧代-3-甲基丁酸；

包括以下步骤：

(1)分别用空白基质稀释相同浓度的混标储备液R0得到不同浓度的标准品储备液和高中低三种浓度的质控品溶液；

(2)对样本的处理：通过用胰酶消化细胞，并离心后用PBS清洗，之后用混合溶液提取剂提取，冷冻、破碎，得到样本溶液；其中，混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈混合而成；

(3)有机酸的测定；

将样本溶液、质控品溶液和标准品储备液进行检测；

检测条件如下：

色谱条件：

流动相A液：0.05-0.3％的甲酸水溶液；

流动相B液：0.05-0.3％甲酸的乙腈溶液；

色谱柱型号：kinetexPS-C18，C8或PFP柱；

柱规格为2.1mm×50mm，2.6μm，2.1mm×100mm，2.6μm或者2.1mm×150mm，3μm；

采用梯度洗脱的方式，洗脱梯度如下：在0-3.5min，流动相B液的体积分数升到第一体积分数，在3.5-3.51min，流动相B液的体积分数降到第二体积分数，在3.51-4min，流动相B液的体积分数维持在第二体积分数；其中，所述第一体积分数为45％-55％；所述第二体积分数为0-5％；

流速：0.1-0.5mL/min，柱温为25-40℃，进样1-10μL。

2.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源，负离子模式；

喷雾毛细管电压：-4500V；

离子源温度：500℃；

离子源雾化气：50psi；

离子源加热辅助气：50psi；

气帘气：25psi；

碰撞气：9psi；

扫描模式：多反应监测

各个目标物的质谱参数

3.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，步骤(1)中混标储备液R0及标准品储备液的浓度如下：

4.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，步骤(2)中的样本为肺癌细胞。

5.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，步骤(2)中对样本的处理具体如下：在1.5mLPE离心管中用胰酶消化肺癌细胞，并进行离心，离心收集固体后用100-500μLPBS溶液清洗，之后用400-800μL的水、甲醇和乙腈的混合溶液提取剂提取，提取液在液氮中冷冻5-10min，之后室温融化后超声破碎细胞，沉淀过夜，并再次离心，取上清液，得到细胞裂解液；即为样本溶液。

6.根据权利要求4所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，所述混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈按比例：水：甲醇：乙腈＝1：1：1或水：甲醇：乙腈＝1：1：2或水：甲醇：乙腈＝1：2：2或水：甲醇：乙腈＝2：2：1混合得到。

7.根据权利要求1所述的一种高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：用外标法通过绘制标准曲线进行定量计算；其中标准曲线以标准品溶液的浓度为X轴，以每一浓度相对应峰的面积为Y轴，进行线性回归分析，得到对应4种有机酸的外标曲线。

8.一种用于权利要求1所述的高效测定细胞裂解液中4种有机酸的方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标准品、稀释剂、混合溶液提取剂和流动相；

其中，稀释剂包括甲醇和空白基质；

标准品如下：α-酮戊二酸标准品、琥珀酸标准品、4-甲基-2-氧戊酸标准品和2-氧代-3-甲基丁酸标准品；

混合溶液提取剂由水、甲醇和乙腈按比例：水：甲醇：乙腈＝1：1：1或水：甲醇：乙腈＝1：1：2或水：甲醇：乙腈＝1：2：2或水：甲醇：乙腈＝2：2：1混合得到；

流动相包括流动相A液和流动相B液；流动相A液为0.05-0.3％的甲酸水溶液；流动相B液为0.05-0.3％甲酸的乙腈溶液。