[发明专利]检测PDCoV的RT-RAA-LFD引物对、探针、试纸条、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及动物疫病检测技术领域，具体涉及检测PDCoV的RT‑RAA‑LFD引物对、探针、试纸条、试剂盒及其应用。本发明以PDCoV的ORF1b基因为诊断靶标，设计、筛选、优化并最终获得了能够特异性检测PDCoV核酸的引物对与探针。使用本发明的引物对、探针、试剂盒和试纸条可以实现对PDCoV的快速检测，等温扩增所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行结果判读。整个检测过程无需昂贵的仪器设备，仅通过肉眼判读即可获得检测结果。本发明在基层和现场快速检测与甄别PDCoV感染方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，具体涉及一种检测PDCoV核酸的RT-RAA-LFD引物对、探针、试纸条、试剂盒及应用。

背景技术

PDCoV是近年来新发现的一种猪肠道致病性冠状病毒，主要感染新生仔猪，临床症状表现为急性腹泻、呕吐、脱水和消瘦等，严重者发生死亡，已成为影响养猪生产的重要病原之一；尽管其他年龄阶段的猪也可以感染，但症状相对轻微。PDCoV既可以通过健康猪直接接触带毒猪或患病猪的多种分泌物(如粪便、呕吐物、唾液、乳汁、鼻腔分泌物和精液等)而发生感染，也可以通过间接接触受病毒污染的饲料、器具、运输工具和饲养员等而发生感染。2012年，Woo等从2007～2011年间采集的猪粪便拭子中首次测得PDCoV的全基因组序列。

已有研究表明，除了感染猪之外，PDCoV也能够感染野鸟、鸡、火鸡、牛等不同种属动物，说明该病毒具有潜在的跨物种传播风险(Zhang J.,Virus Research,2016,226:71-84)。2021年，有研究从3名具有发热和腹痛症状的海地儿童血液中分离出PDCoV，表明PDCoV具有潜在的公共卫生意义(Lednicky J.A.,Nature,2021,600:133-137)。

在分类上，PDCoV属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ冠状病毒属(Deltacoronavirus)。PDCoV是有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组结构为：5’UTR-ORF1a/1b-S-E-M-NS6-N-NS7-3’UTR，全长约25kb。其中ORF1a和ORF1b编码两个多聚蛋白pp1a和pp1ab，据推测，pp1a和pp1ab可被ORF1a/1b编码的蛋白酶切割成约16个非结构蛋白，主要参与病毒复制与转录。鉴于PDCoV感染所导致的临床症状与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRoV)等重要致猪腹泻性病毒十分相似，因此确诊PDCoV感染需要依靠实验室检测技术。目前，国内外主要依靠RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR和环介导等温扩增(LAMP)等分子生物学方法以及间接免疫荧光、病毒中和试验以及间接ELISA等血清学方法对PDCoV感染进行检测与诊断。其中，RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR和LAMP等分子生物学检测方法涉及到的诊断靶标包括S、M、N和ORF1等基因。尽管上述检测方法在PDCoV的检测与诊断中发挥了重要作用，但均普遍存在操作复杂、耗时长、对仪器设备要求较高或引物设计过于复杂等不足，难以满足临床上对PDCoV感染猪进行现场快速和可视化检测的实际需求。

近年来，一种基于重组酶介导等温核酸扩增(Recombinase-aidedamplification，RAA)技术在人医和兽医疾病诊断与检测中正在显示出良好的应用潜力，已经引起了全世界的广泛关注。譬如，基于RAA与侧向流免疫层析技术的病原体核酸检测方法已经成功应用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和非洲猪瘟病毒(ASFV)的快速诊断，并已经申请了国家发明专利保护。RAA技术主要依靠单链DNA结合蛋白(通过与单链DNA结合，维持DNA的单链状态，防止其重新配对形成双链DNA)、重组酶(能与引物形成复合物，促进引物与模板DNA的同源序列配对，启动DNA复制)和DNA聚合酶(用于扩增和延伸)在恒温条件下(37～42℃)短时间内(≤20min)完成对目标核酸的扩增。