[发明专利]一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用

说明书

本发明公开了一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用，构建病毒蛋白的随机突变文库，并将所述的随机突变文库导入慢病毒质粒载体获得慢病毒质粒文库；将所述的慢病毒质粒文库包装假病毒，并与中和抗体中和后，感染表达血管紧张素转化酶2和细胞丝氨酸蛋白酶的细胞，筛选出表达绿色荧光的细胞，并提取DNA进行序列分析，即可筛选出能逃逸中和抗体的病毒序列。本发明的筛选体系可用于预测逃逸中和抗体的病毒序列，简便，高效，为病毒蛋白与宿主的研究提供新的平台。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种病毒蛋白逃逸中和抗体的筛选方法及应用。

背景技术

2019年新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是继2002年暴发严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV)疫情及2012年暴发中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)疫情之后的第三种高致病的冠状病毒。目前为止，新冠肺炎全球确诊数量累计超1亿，累计死亡病例250万以上，给人类社会带来前所未有的灾难。

随着SARS-CoV-2世界范围内的大规模传播，使得传统漫长的疫苗开发进程空前加快，而与此同时，SARS-CoV-2也处于变异之中。最近的研究发现，在过去的1年里，已经在全球各地患者体内采集的新冠病毒样本中发现了接近30000个突变并且其中超过75个可以遗传，预测未来1年内可能产生传染性和致病性更强的新冠病毒毒株，新冠病毒变异株的出现给疫苗预防和中和抗体治疗带来了巨大挑战。

研究表明，SARS-CoV-2入侵机体细胞主要依靠的是其表面的特殊结构刺突蛋白(spikeprotein，Sprotein)。S蛋白可以特异性识别人类血管紧张素转化酶2(humanangiotensinconvertingenzyme 2，hACE2)，并促进病毒膜与细胞膜融合，从而最终介导冠状病毒进入宿主细胞，引发感染。S蛋白合成过程中，被蛋白酶水解成S1和S2两个亚单位。其中S1中的受体结合结构域(receptor binding domain，RBD)直接与ACE-2的肽酶区(peptidase domain，PD)结合，是病毒细胞嗜性及病毒入侵的决定区域。

目前，新冠康复者血清和中和抗体治疗是临床有效的抗新冠病毒疗法之一。新冠中和抗体主要靶向病毒S蛋白的RBD区，竞争性地与ACE-2受体结合，从而达到阻滞病毒感染的目的，并且靶向RBD的抗体通常在自然感染引起的多克隆抗体反应的中和活性中起着关键性作用。然而已有文献报道，即使利用SARS-CoV-2的S蛋白假病毒体系，在RBD中和抗体存在的条件下，S蛋白也会产生逃逸突变体，这给病毒疫苗推广应用和中和抗体治疗带来了巨大挑战。在WHO公布的初代新冠疫苗中，包括mRNA疫苗、DNA疫苗、载体类疫苗、亚单位蛋白疫苗、VLP疫苗等，多选用全长S蛋白或S蛋白的RBD作为抗原靶标。且新一代新冠基因工程疫苗概念设计采用了RBD和NTD(氨基末端结构域)双组分亚单位新冠疫苗，在兔子和猕猴实验中验证了该疫苗诱导产生的中和抗体水平，显著高于初代新冠疫苗。