[发明专利]以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用

说明书

本发明提供了以β‑吲哚基丙氨酸为底物合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的方法及其应用。本发明提供的5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸高产菌株，用于以β‑吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的方法，5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的合成产量高。本发明通过对BH4再生系统的构建，新的BH4再生酶的挖掘，加强了工程菌株BH4的再生能力，尤其是双BH4再生系统的同时作用，显著提升了生物合成5‑羟基β‑吲哚基丙氨酸的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种以β-吲哚基丙氨酸为底物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法及其应用。

背景技术

5-羟基β-吲哚基丙氨酸广泛存在于豆科植物的种子中，其中非洲植物加纳的种子中含量最高。从加纳籽中提取和精制5-羟基β-吲哚基丙氨酸的基本工艺路线为：加纳籽粉碎—萃取—过滤离心—物理脱色—真空浓缩—结晶、重结晶—真空干燥。但随着非洲加纳树数量不断减少，传统提取法获得5-羟基β-吲哚基丙氨酸变得越来越困难，作为人体神经代谢途径中抵抗抑郁、缓解情感性精神障碍的天然药物，近年来5-羟基β-吲哚基丙氨酸的市场需求越来越大，依靠天然产物提取己难以满足市场需求，越来越多的企业开始从化学合成与生物发酵等方面研究5-羟基β-吲哚基丙氨酸的生产。

目前所报道的生物合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的合成方法，大部分是先合成β-吲哚基丙氨酸后再羟化其生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸。β-吲哚基丙氨酸的生物合成方法目前已比较成熟。但是β-吲哚基丙氨酸羟化生成5-羟基β-吲哚基丙氨酸需要有BH4为辅因子参与才能进行，而BH4难以储存且价格昂贵，这使得通过额外添加BH4以工业化生产5-羟基β-吲哚基丙氨酸成为不可能。

而微生物中又没有BH4的合成路径，要想在微生物中合成则必须通过外源基因的加入。本发明通过对工程菌的BH4合成和再生能力的加强，并通过双BH4再生系统的应用，提高了5-羟基β-吲哚基丙氨酸的产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为提供5-羟基β-吲哚基丙氨酸高产菌株、构建以及以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

提供一种以β-吲哚基丙氨酸为底物生物法合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸的方法，包括以下步骤：

1)利用所述的合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因或能够表达合成β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因的重组基因工程菌，以β-吲哚基丙氨酸为底物，生物发酵合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸，所述的能够表达合成5-羟基β-吲哚基丙氨酸蛋白编码基因包括β-吲哚基丙氨酸产5-羟基β-吲哚基丙氨酸途径关键酶基因TPH2；BH4合成基因FOLE、PTPS、SPR；BH4再生酶基因包括PCD基因、qBH2产BH4再生酶基因QDPR和BH2产BH4再生酶基因DHFR；

2)从1)的体系中分离得到5-羟基β-吲哚基丙氨酸。

按上述方案，PCD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，qBH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6-10中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11-15中任一序列所示。

优选地，所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:6，和SEQ IDNO:8中任一序列所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14中任一序列所示。

更优选地，所述BH2产BH4再生酶基因QDPR的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；BH2产BH4再生酶基因DHFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。