[发明专利]一种利用马蔺DFR基因获得基因转化植物的方法

说明书

本发明提供了一种表达马蔺DFR基因的重组表达载体，以及包含该重组表达载体的宿主细胞、基因转化的植物细胞和植株，以及它们在培育合成蓝色花青素的植物方面的应用，尤其是培育新花色或新果色的植物品种方面的应用，特别是培育蓝色花卉品种方面的应用。

技术领域

本发明涉及一种表达马蔺DFR基因的重组表达载体，以及包含该重组表达载体的宿主细胞、基因转化的植物细胞和植株，以及它们在培育合成蓝色花青素的植物方面的应用，尤其是培育新花色或新果色的植物品种方面的应用，特别是培育蓝色花卉品种方面的应用。

背景技术

马蔺(Iris lactea Pall.var.chinensis(Fisch.)Koidz,以下简称I.lacteavar.chinensis)为鸢尾科鸢尾属多年生草本宿根植物，是白色马蔺的变种，又名马兰花、马莲花等，广泛分布于我国东北、华北、西北等地，为宁夏银川市市花。

马蔺的花瓣主要呈蓝色、淡蓝色或蓝紫色。众所周知的，花青素是构成花瓣颜色的主要色素之一。然而，目前关于马蔺的花青素生物合成途径、花色呈色机理的研究鲜有报道。

一般来说，二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是花青素生物合成途径的关键酶；DFR能够在NADPH辅助因子的作用下，分别催化二氢槲皮黄酮(Dihydroquercetin,DHQ)、二氢山奈黄酮醇(Dihydrokaempferol,DHK)和二氢杨梅黄酮(Dihydromyricetin,DHM)三种底物，生成对应的无色矢车菊色素、无色天竺葵色素和无色飞燕草色素(三种无色原花青素)；花青素合酶(Anthocyanidin 4-synthase,ANS)再将这三种无色原花青素转化成与花色产生直接相关的花青素，即矢车菊色素(品红色)、天竺葵色素(红色)和飞燕草色素(蓝紫色)；其中，飞燕草色素又称蓝色花青素。植物呈现的花色和果色是这三种色素综合的结果。

为揭示马蔺的花青素生物合成途径，本申请发明人所在的实验室以马蔺花瓣为试材，通过转录组测序，应用PCR技术克隆了马蔺DFR基因并获得其生物信息学特征(参见文献：虎娟等，马蔺DFR基因的克隆及生物信息学特征分析，北方园艺2017(24)：109-115)。

大部分物种的DFR基因编码的蛋白氨基酸数量在300～400之间，并且DFR编码的蛋白至少存在两个经典的结构域，一个是高度保守的、与NADPH结合的结构域，另一个是与底物结合的结构域，其大致位于DFR所编码蛋白的第132～157位氨基酸附近。

然而，不同物种的DFR在花青素生物合成中对DHM、DHK和DHQ这三种底物的选择有差异性，例如有底物偏好性、催化效率也不同；正因如此，不同植物中合成的花青素种类不同，从而呈现出不同的颜色。例如，非洲菊的DFR能以DHM、DHK和DHQ为底物；矮牵牛DFR则主要催化DHM，对DHK没有催化作用，也因此矮牵牛缺乏橙色的天竺葵色素。另外，不同物种的DFR基因在不同生长时期、不同部位的表达量也不同，如在矮牵牛中分离了3种DFR基因(DFRA、DFRB和DFRC)，但只有DFRA基因在花中转录表达，在胚珠和茎中只有微量表达。

目前，虽已成功克隆马蔺的DFR基因，但对于马蔺DFR的底物特异性偏好，以及其如何改变花色的背后机理并不清楚，从而限制了对马蔺的DFR基因的具体应用，例如在培育合成蓝色花青素的植物方面的应用，尤其是培育新花色或新果色的植物品种方面的应用。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明第一方面提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含第一基因表达盒和第二基因表达盒；

所述第一基因表达盒为表达马蔺DFR基因的表达盒；所述第一基因表达盒包含编码马蔺DFR的基因序列；所述编码马蔺DFR的基因序列如SEQ ID No:1所示或与SEQ ID No:1所示序列具有80％以上序列同源性；