[发明专利]一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用。该MccY重组整合工程菌的构建方法包括如下步骤：(1)将sgRNA片段(SEQ ID NO.2)与T载体连接，得到pHsgRNA质粒；(2)将pCas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的MccY的修复片段(SEQ ID NO.1)和pHsgRNA质粒转入感受态细胞中，经鉴定、培养、连续传代筛选消除双质粒的菌株，得到所述的MccY重组整合工程菌。本发明中构建得到的MccY重组整合工程菌无质粒无抗性基因，无需诱导剂，能够持续高效地分泌表达MccY，对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌等有明显的抑制效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

近年来，抗生素的过度使用引发了很多问题，抗生素的耐药和多重耐药现象愈发受到关注。而在提出的替代方法中，天然抗菌剂有着极大的潜力，是下一代药物的有效材料。

小菌素(Microcin，Mcc)是低分子量、核糖体产生的、高度稳定的细菌抑制分子，是一种抗菌肽，参与肠道中肠杆菌科之间的竞争，具有热稳定性、耐酸性、以及对蛋白酶具有一定的抗性等显著优点。现已鉴定出大约15种小菌素，共分为两类，Ⅰ类小菌素小于5kDa，由质粒编码，Ⅱ类小菌素约5～10kDa，可分为质粒编码和染色体编码。不同的小菌素具有不同的抗菌机制，通过阻断靶细胞的重要功能从而达到抗菌的作用。与抗生素不同，它们通常在纳摩尔浓度下就具有活性。

目前对于小菌素的应用尚不普遍，研究较多的小菌素，如小MccJ25等，抗菌谱较窄。最新发现的MccY拓宽了小菌素的抗菌谱，包括几种代表性的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌菌株，有着极大的替抗潜力。但是，目前MccY的研究尚停留在质粒表达的层面，如何实现微生态制剂，如何安全地利用并高效、持续地放大生产MccY还需要进一步探索。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种MccY重组整合工程菌的构建方法。

本发明的另一目的在于提供所述方法构建得到的MccY重组整合工程菌。

本发明的再一目的在于提供所述MccY重组整合工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种MccY重组整合工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将sgRNA片段与T载体连接，得到pHsgRNA质粒；其中，sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)将pCas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的MccY的修复片段和步骤(1)中得到的pHsgRNA质粒转入感受态细胞中，经培养、连续传代筛选消除双质粒(pHsgRNA质粒、pCas9质粒)的菌株，得到所述的MccY重组整合工程菌；其中，优化后的MccY的修复片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌MG1655。

步骤(2)中所述的感受态细胞通过本领域的常规方法制备得到，优选为通过如下方法制备得到：将pCas9质粒通过热激的方式转化大肠杆菌感受态细胞，然后加入培养基进行培养，培养后进行鉴定；再将鉴定正确的菌株接入培养基中，放大培养，取菌体，于冰上用体积分数15％的甘油洗菌3～5次，制得感受态细胞。

步骤(2)中所述的培养基为LB培养基。

步骤(2)中所述的连续传代筛选消除双质粒通过如下方法实现：将转化后获得的重组菌株连续传代，挑取单菌落分别在含有30μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的抗性平板、以及无抗生素的平板中进行穿刺筛选，找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，然后通过PCR 检测确认质粒丢失状态，筛选得到无质粒、无抗性基因的MccY重组整合工程菌。