[发明专利]一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将sgRNA片段与T载体连接，得到带有sgRNA的质粒；其中，sgRNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）将pCas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的MccY的修复片段和步骤（1）中得到的带有sgRNA的质粒转入感受态细胞中，经培养、连续传代筛选消除双质粒的菌株，得到所述的MccY重组整合工程菌；其中，优化后的MccY的修复片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的连续传代筛选消除双质粒通过如下方法实现：将转化后获得的重组菌株连续传代，挑取单菌落分别在含有30μg/mL氯霉素和100μg/mL氨苄青霉素的抗性平板、以及无抗生素的平板中进行穿刺筛选，找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，然后通过PCR检测确认质粒丢失状态，筛选得到无质粒、无抗性基因的MccY重组整合工程菌；

所述的PCR检测所需的引物序列如下：

pCas9丢失检测引物：

上游引物：5’- GAGCTGGTGATATGGGATAG-3’；

下游引物：5’- CATTCATCCGCTTATTATCAC-3’；

带有sgRNA的质粒的丢失检测引物：

上游引物：5’- GAGTGAGCTGATACCGCTCG-3’；

下游引物：5’- CTTCGCTATTACGCCAGCTG-3’。

3.根据权利要求1所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。

4.根据权利要求1所述的MccY重组整合工程菌的构建方法，其特征在于：还包括进一步将步骤（2）中得到的MccY重组整合工程菌利用引物进行PCR鉴定的步骤；

所述的PCR鉴定所需的引物序列如下所示：

hsds text-F：5’- gccgaagagacggaagttgc -3’；

hsds text-R：5’- ctcgcaggttacggtaagac -3’。

5.一种MccY重组整合工程菌，其特征在于：通过权利要求1～4任一项所述的方法构建得到。

6.权利要求5所述的MccY重组整合工程菌在制备小菌素MccY中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将权利要求5所述的MccY重组整合工程菌接种到培养基中进行培养，离心，取上清，得到小菌素MccY。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述的培养的转速为150～300 rpm/min；

所述的培养的温度为37±2℃；

所述的培养的时间为4小时以上。

9.权利要求5所述的MccY重组整合工程菌在制备抗菌剂中的应用，其特征在于：所述的菌为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌中的至少一种。