[发明专利]一种甘蔗花粉孢子的提取方法

说明书

本发明属于植物组织培养技术领域，提供一种甘蔗花粉孢子的提取方法，首先将消毒的甘蔗幼穗的小花对半剪开，在研钵中研磨至幼穗组织破碎；把研磨后的幼穗组织转移至离心管中进行振荡，振荡后使用100目、400目细胞筛过滤；对过滤后的浆液进行三次离心，收集底部的花粉孢子；往另一支空的离心管中加入质量分数为20％的麦芽糖溶液，将花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，加入CPW缓冲液，进行第四次离心，使花粉孢子在离心管中形成两条明显的环形带，即悬浮在上方的活细胞带和沉在底部的死细胞带；收集在界面上形成活细胞带的花粉孢子。本发明能够高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，为提高甘蔗花培成功率打下基础。

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种甘蔗花粉孢子的提取方法。

背景技术

用组织培养或诱导系诱发单倍体，再通过染色体加倍产生纯合度为100％的双单倍体(Doubled Haploid,DH)，是一种快速创制纯系(即DH系)的途径。在此基础上发展形成的单倍体育种技术，只需2～3个世代即可创制自交系，能大幅缩短育种周期、提高育种效率。更为重要的是，单倍体育种技术的成熟发展，为作物基因组选择育种提供了重要支撑。在我国广泛应用的获得单倍体植株的方式之一则为花药培养。花药培养技术是应用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后由胚状体直接发育为植株或使愈伤组织分化成植株。其是单倍体育种技术的典型代表，具有选择周期短、性状选择准确、创造变异和DH群体快等独特优势。近几年，油菜、水稻、小麦、玉米等作物的双单倍体材料推动了栽培品种的改良。但与小麦、玉米、水稻等农作物相比，甘蔗花药离体培养的特殊性较高，且由于甘蔗生长周期较长等限制因素，导致甘蔗花药培养的成功率普遍较低，在农业领域，甘蔗花药离体培养的理论研究相对较少，直至目前，国内只有陈正华等人(1980)曾报道过成功培育了花粉植株，但对甘蔗花培技术体系并无详细说明。在甘蔗花培技术体系中，如何高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，是甘蔗花培的第一步，也是影响甘蔗花培成功率的关键一步。

甘蔗花序属于大型圆锥花序，由许多小穗组成。小穗是禾本科的典型特征，由颖片、小花和小穗轴组成，小花从外到内依次是外稃、内稃、浆片、3个花药，甘蔗长柄腺毛着生在小花的基部。浓密的长柄腺毛、包裹紧实的颖片和内外稃是甘蔗花粉孢子提取的主要障碍。要想获得杂质少、纯度高、数量充足的甘蔗花粉孢子，单靠简单的研磨及过滤是不够的。如果只是进行简单的研磨，花药中的花粉孢子难以从包裹紧实的颖片内释放出来，且数量众多的长柄腺毛会对花粉孢子形成缠绕或者黏连效果，使得过滤后的滤液中的花粉孢子数量大大降低。因此，如何高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种甘蔗花粉孢子的提取方法，能够高效地提取纯度高、活力强的花粉孢子，为提高甘蔗花培成功率打下基础。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种甘蔗花粉孢子的提取方法，包括以下步骤：

(1)将消毒的甘蔗幼穗的小花对半剪开，在灭菌后的研钵中研磨至幼穗组织破碎；

(2)把研磨后的幼穗组织转移至离心管中；

(3)加入含5V/V％甘露醇的CPW缓冲液至步骤(2)的离心管中；

(4)使用旋涡混合器或振荡器振荡步骤(3)的离心管，得幼穗匀浆；

(5)使用100目细胞筛过滤振荡后的幼穗匀浆，弃掉残渣，保留滤液；

(6)使用400目细胞筛过滤上一步得到的滤液，弃掉组织碎片，得到过滤后的浆液；

(7)将过滤后的浆液装入离心管中；

(8)将步骤(7)的离心管放入离心机中进行第一次离心；