[发明专利]一种甘蔗花粉孢子的提取方法

权利要求书

1.一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将消毒的甘蔗幼穗的小花对半剪开，在灭菌后的研钵中研磨至幼穗组织破碎；

(2)把研磨后的幼穗组织转移至离心管中；

(3)加入含5V/V％甘露醇的CPW缓冲液至步骤(2)的离心管中；

(4)使用旋涡混合器或振荡器振荡步骤(3)的离心管，得幼穗匀浆；

(5)使用100目细胞筛过滤振荡后的幼穗匀浆，弃掉残渣，保留滤液；

(6)使用400目细胞筛过滤上一步得到的滤液，弃掉组织碎片，得到过滤后的浆液；

(7)将过滤后的浆液装入离心管中；

(8)将步骤(7)的离心管放入离心机中进行第一次离心；

(9)第一次离心后弃掉上清液，加入含5V/V％甘露醇的CPW缓冲液，用细滴管轻轻吹打混匀花粉孢子；

(10)将步骤(9)的离心管进行第二次离心；

(11)第二次离心后弃掉上清液，加入含5V/V％甘露醇的CPW缓冲液，进行第三次离心；

(12)第三次离心后再次倒出上清液，收集沉在离心管底部的花粉孢子；

(13)往另一支空的离心管中加入质量分数为20％的麦芽糖溶液，将步骤(13)的花粉孢子重悬在麦芽糖溶液上，小心地再加入含5V/V％甘露醇的CPW缓冲液；

(14)将步骤(13)中的离心管放入离心机中，进行第四次离心或静置30min-90min，使花粉孢子在离心管中形成两条明显的环形带，即悬浮在上方的活细胞带和沉在底部的死细胞带；

(15)收集在界面上形成活细胞带的花粉孢子。

2.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(1)中所述的甘蔗幼穗采用75％的酒精进行表面消毒。

3.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，使用无菌镊子和剪刀将甘蔗幼穗的小花对半剪开。

4.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(4)中，振荡所述离心管的时间为1-2min。

5.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(8)中所述的第一次离心的转速为2000r/min，离心时间为5min，步骤(10)中所述的第二次离心的转速为2000r/min，离心时间为5min。

6.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(11)中所述的第三次离心的转速为2000r/min，离心时间为5min。

7.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(14)中所述另一支空的离心管为10mL离心管，加入的麦芽糖溶液体积为7ml，加入的含5V/V％甘露醇的CPW缓冲液的体积为2mL。

8.根据权利要求1所述的一种甘蔗花粉孢子的提取方法，其特征在于：步骤(15)中第四次离心的转速为500r/min，离心时间为5min。