[发明专利]一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用

说明书

本发明公开了一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选而成，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株生物催化对羟基苯甲酸甲酯合成原儿茶酸甲酯。本发明生物合成原儿茶酸甲酯的菌株作为催化剂，以生物合成的方式获得原儿茶酸甲酯，能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性。

技术领域

本发明涉及一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

原儿茶酸甲酯，又名3，4二羟基苯甲酸甲酯，能显著增强神经元细胞的活性，促进神经元突起生长，使神经网络更发达，与神经营养因子的作用类似，可在成人神经细胞的存活、突起生长、神经网络构建以及神经系统的可塑性等方面发挥关键性的作用，在防治神经退行性疾病及其他相关疾病方面具有较强的应用价值。但目前原儿茶酸甲酯大多采用化学合成的方式获得，所使用的危化品试剂较多，所需的能量较大，对人体存在一定的伤害。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用，本发明以含有KPHS基因的质粒为模板，构建重组菌株sHG10，以该菌株为催化剂，以生物合成的方式制备原儿茶酸甲酯，能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性能够减少化学试剂的使用量，降低对人体的毒害性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选而成；所述KPHS基因片段是含有KPHS基因的质粒经扩增获得，所述线性化表达质粒载体是表达质粒经反向扩增、消化获得。

其中，所述表达质粒为pet20b、pET28a或pThioHisA的一种；pet20b的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，pET28a的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示，pThioHisA的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。

其中，所述KPHS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1~SEQ ID No.14所示的任一序列。

其中，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌W3110或大肠杆菌MG1655的一种。

本发明还提供了一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株的构建方法，具体步骤如下：

一、环形质粒pHG10构建

（1）KPHS基因片段：以含有KPHS基因的质粒为模板，通过引物KPHS-F/KPHS-R进行PCR扩增，获得KPHS基因片段；

（2）线性化表达质粒载体：以表达质粒为模板，通过引物质粒-F/质粒-R进行反向扩增，得到PCR产物，经过纯化、I消化，获得线性化表达质粒载体；

（3）环形质粒pHG10：将上述的KPHS基因片段和上述的线性化表达质粒载体进行连接环化，获得环形质粒pHG10；

二、重组菌株sHG10构建

（1）复苏培养：将0.2~5μl质粒pHG10以化学转化法导入50μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min后于42℃水浴中热激60s进行热休克处理，再进行冰浴2min，接着再加入1mL的LB液体培养基，在37℃下培养1h，获得复苏细胞液；

（2）平板培养：将复苏细胞液涂布在LB琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，长出菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组菌株sHG10，即生物合成原儿茶酸甲酯的菌株；

LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水；LB琼脂糖平板的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂10g，其余纯水。