[发明专利]一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株及应用

权利要求书

1.一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，该生物合成原儿茶酸甲酯的菌株是KPHS基因片段与线性化表达质粒载体连接环化的质粒pHG10转化导入大肠杆菌感受态细胞筛选而成；

所述KPHS基因片段是含有KPHS基因的质粒经扩增获得；

所述线性化表达质粒载体是表达质粒经反向扩增、消化获得。

2.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述表达质粒为pet20b、pET28a或pThioHisA的一种；pet20b的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，pET28a的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示，pThioHisA的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。

3.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述KPHS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1~SEQ ID No.14所示的任一序列。

4.根据权利要求1所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌W3110或大肠杆菌MG1655的一种。

5.根据权利要求1至权利要求4任一所述的生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述生物合成原儿茶酸甲酯的菌株的构建方法，包括以下步骤：S1、环形质粒pHG10构建

S1.1、KPHS基因片段：以含有KPHS基因的质粒为模板，通过引物KPHS-F/KPHS-R进行PCR扩增，获得KPHS基因片段；

S1.2、线性化表达质粒载体：以表达质粒为模板，通过引物质粒-F/质粒-R进行反向扩增，得到PCR产物，经过纯化、I消化，获得线性化表达质粒载体；

S1.3、环形质粒pHG10：将上述的KPHS基因片段和上述的线性化表达质粒载体进行连接环化，获得环形质粒pHG10；

S2、重组菌株sHG10构建

S2.1、复苏培养：将0.2~5μl质粒pHG10以化学转化法导入50μl大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min后于42℃水浴中热激60s进行热休克处理，再进行冰浴2min，接着再加入1mL的LB液体培养基，在37℃下培养1h，获得复苏细胞液；

S2.2、平板培养：将复苏细胞液涂布在LB琼脂糖平板上，在37℃下过夜培养，长出菌落，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得重组菌株sHG10，即生物合成原儿茶酸甲酯的菌株；

LB液体培养基的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余纯水；LB琼脂糖平板的配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂10g，其余纯水。

6.根据权利要求5所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，所述引物KPHS-F/KPHS-R中：KPHS-F的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示，KPHS-R的核苷酸序列为SEQID No.9所示。

7.根据权利要求5所述的一种生物合成原儿茶酸甲酯的菌株，其特征在于，表达质粒为pet20b时，质粒-F/质粒-R为pet20b-F/pet20b-R，则pet20b-F的核苷酸序列为SEQ IDNo.10所示，pet20b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示；

表达质粒为pET28a时，质粒-F/质粒-R为pET28a-F/pET28a-R，则pET28a-F的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示，pET28a-R的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示；

表达质粒为pThioHisA时，质粒-F/质粒-R为pThioHisA-F/pThioHisA-R，则pThioHisA-F的核苷酸序列为SEQ ID No.14所示，pThioHisA-R的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。