[发明专利]精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒

说明书

本发明提供一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其步骤包括：选取目标大肠杆菌宿主菌，进行培养表达，获取大肠杆菌宿主细胞蛋白；用大肠杆菌宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的大肠杆菌宿主细胞蛋白。还公开了相应的ELISA检测试剂盒。本发明利用含有高覆盖率的大肠杆菌HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的大肠杆菌HCP蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。

技术领域

本发明专利涉及一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及 ELISA检测试剂盒。

背景技术

大肠杆菌是最早用于重组蛋白表达的宿主菌，大肠杆菌表达系统较其它表达系统具有多种优势，其在生物制品产业化应用价值如下：1)结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是对基因表达调控机制有清楚的了解；2)易于大规模培养，培养周期短，成本低廉；3)抗污染能力强；4)经过一系列遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有了各种不同的菌株和载体系统；目前为止，大肠杆菌在蛋白质表达领域仍被认为是主要的工具。

大肠杆菌中重组表达是一种相对简单和经济有效的生产某些蛋白质和DNA的方法。这些产品中有许多是用于人类和动物的治疗剂，因此，必须高度提纯。这些产品的制造和纯化过程中，存在来自大肠杆菌宿主细胞蛋白(HCP)杂质的可能性。这些杂质会降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此需要将HCP杂质降至最低水平。

HCP又称宿主细胞蛋白，是生物制品的关键质量属性，影响着生物制品的质量、安全性与有效性。夹心法ELISA检测试剂盒是检测HCP残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中HCP抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若ELISA检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的HCP，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性问题。美国药典UPS 1132对HCP抗体覆盖率检测提出了新的要求，建议使用 2D-SDS-PAGE/Western或DIGE方案对ELISA检测试剂盒中HCP抗体进行覆盖率验证。

本试剂盒采用微量滴度板免疫酶联免疫测定(ELISA)方法。该方法使用的抗体是经过 DIGE法检测过的高覆盖率抗体，平台特异性的HCP抗体覆盖率越高，对HCP的定量越准确，因此，本发明是针对大肠杆菌宿主细胞蛋白(HCP)残留进行更加精确的快速评估。发明内容

本发明的目的是提供一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法。

一种精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法，其特征在于其步骤包括：

(1)选取目标大肠杆菌宿主菌，进行培养表达，获取大肠杆菌宿主细胞蛋白；

(2)用大肠杆菌宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体；

(3)利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗大肠杆菌宿主细胞蛋白多克隆抗体进检测；

(4)选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用ELISA法检测样本中残留的大肠杆菌宿主细胞蛋白。

优选的，步骤(1)中所述的目标大肠杆菌宿主菌为ATCC35218和/或ATCC25922。

优选的，步骤(2)中的动物选择家兔。

优选的，步骤(2)中免疫次数为5次，分别为在第0、14、28、42、56天进行，其中最后一次免疫为冲击免疫。

优选的，步骤(3)中的检测方法为蛋白质荧光差异双向电泳法