[发明专利]肺纤维化体外模型的构建方法

说明书

类器官肺纤维化体外模型的构建方法，步骤包括：(1)获取肺组织，清洗、剪碎；(2)置于trypsin或IV型胶原酶中，摇晃消化获得细胞小团块；(3)用2倍HBSS终止消化，离心收集细胞沉淀；(4)进行红细胞裂解处理后，一部分细胞种胶，胶滴凝固后加入类器官培养基进行类器官培养，另一部分细胞用成纤维细胞培养基贴壁培养，获得成纤维细胞；(5)肺类器官纤维化模型的构建；(7)成纤维细胞‑肺类器官共培养体系的纤维化模型的构建；(8)成纤维细胞‑免疫细胞‑肺类器官共培养体系的纤维化模型的构建。本发明的方法为肺纤维化疾病机制的研究、新药研发、药物敏感性检测和临床前患者反应性监测提供更有利的支持。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及三种肺纤维化体外模型的构建方法，分别是肺类器官的纤维化模型、成纤维细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型和成纤维细胞-免疫细胞-肺类器官共培养体系的纤维化模型。

背景技术

肺与人体呼吸息息相关，一旦肺部出现严重病变将会大大影响人的生活质量。肺纤维化即Pulmonary Fibrosis(PF)，是一种由多种病因引起的慢性进行性肺间质疾病，特发性PF(IPF)是临床常见和具有代表性的慢性肺纤维化。IPF病因不明，主要影响的是60-75岁的男性，患病率为每10万人口13～20人，平均生存期只有3～5年，5年生存期仅有30％。目前肺移植和药物治疗是针对IPF常见的治疗手段，肺移植受限于肺源、手术条件、治疗费用、年龄等因素的干扰，甚至存在慢性同种异体移植功能障碍和感染的严重风险；FDA获批的IPF治疗药物(吡非尼酮和尼达尼布)只能减缓患者的肺功能下降，在预防疾病进展和改善生活质量方面疗效有限，甚至还存在药物耐受问题，疾病晚期的患者更是无药可医。因此，构建具有代表性的肺纤维化模型对于疾病机制的研究和药物研发至关重要。

目前常用的特发性肺纤维化(IPF)模型主要包括博来霉素(BLM)处理的动物模型(小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、豚鼠、狗等)以及转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)处理的细胞模型(人胚肺成纤维细胞(MRC-5，HFL1)和II型肺上皮细胞系(A549)等)；近来，利用人干细胞(hPSCs)诱导来源的肺类器官进行纤维化的诱导模型也取得了一定的进展。这些模型在一定程度上可以重现肺纤维化的某些特征，包括成纤维细胞的增殖，以及动物和类器官模型中能够检测到胶原的累积。

细胞模型的缺点在于原代肺上皮细胞获取困难、培养时长有限，永生化细胞系又不能维持源细胞特性等，使得其在模型构建上存在局限性；基于动物模型进行的研究并不一定能阐明人肺组织、发育和疾病特性，研究表明：小鼠肺和人类肺之间存在显著的细胞和分子差异；比如：研究发现依维莫司(具有免疫抑制和抗纤维增殖作用)在大鼠模型中可减轻BLM诱导的肺纤维化，然而，在为期3年的人类研究(设置随机安慰剂为对照)中尚未发现其对IPF的治疗效果，甚至存在过度毒性；此外，还有研究发现TNF-a过表达与肺间质中成纤维细胞增加和ECM蛋白沉积有关，在小鼠模型中注射抗TNF-a的抗体可减少BLM诱导的肺部炎症和纤维化，但在一项II期试验中，依那西普(一种重组人TNF-a受体，结合并灭活TNF-a)在患者治疗中并未显示出显著改善效果，且目前还没有实验动物模型能够模拟在人类中检测到的肺纤维化的所有典型特征；hPSCs诱导的肺类器官主要由上皮细胞组成，非上皮细胞的缺失使其并不能再现真实器官的结构，且诱导的肺类器官时间长，成本高，成熟度低，而肺纤维化是一种与年龄高度相关的疾病。此外，细胞和hPSCs诱导的单一类器官来源的肺纤维化模型缺乏内皮细胞、间质细胞、成纤维细胞以及免疫细胞等相关微环境内的细胞间相互作用，使得其在疾病模拟、药物筛选和研发中存在弊端。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于人/鼠肺组织建立的肺纤维化类器官体外模型的构建方法，建立一种既能缩短实验周期，又能够更贴近肺纤维化组织结构，且包含间质细胞和免疫细胞的肺类器官纤维化体外模型，为疾病模拟和新药研发提供更优化的平台。

本发明的方法按以下步骤进行：