[发明专利]一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法

权利要求书

1.一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：所述纯化方法包括以下步骤：

S1、菌体构建，构建含全能核酸酶目的基因的质粒，所述的目的基因含全能核酸酶序列，且在该序列的前端具有编码6xHis标签和SUMO标签的序列；

S2、发酵表达，将在抗性平板上挑选的单克隆菌株接种至摇瓶培养基生长，待菌浓达到移种要求接种至发酵罐(接种量1％-10％)，发酵培养生长，待菌菌量达到合适浓度，加入诱导剂异丙基-P-D-硫代半乳糖进行诱导表达，且表达的蛋白为可溶表达，待发酵表达结束，收获菌液，离心，收集菌体；

S3、发酵菌体预处理，将步骤二得到的菌体在合适的重悬液中重悬，对其进行菌体破碎，确保所处理菌体均已破碎，然后将破碎液离心，去掉沉淀，收集含目的蛋白的上清液；

S4、层析纯化，将含目的蛋白的上清液通过亲和层析纯化，SUMO蛋白酶酶切，然后再次通过亲和层析，收取流穿液，既得到高纯度的全能核酸酶。

2.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：所述步骤S1中，可使用的表达菌株包括但不局限于BL21(DE3)、Rosetta-gami(DE3)、OrigamiB(DE3)或Rosetta(DE3)大肠杆菌改造后的表达菌株，表达质粒为自构建的pET28a-6xHis-SUMO-NucA，质粒抗性为卡那霉素抗性。

3.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S2中所述的方法，其特征在于，种子摇瓶培养基及发酵培养基包含五类物质，包括碳源，氮源，水，无机盐，微量元素，同时发酵过程需流加补料，具体的配方为：甘油：1-10g/L、蛋白胨：1-20g/L、酵母粉：1-30g/L、磷酸二氢钾：1-10g/L、硫酸镁：1-5g/L和氯化锌：1-3g/L、硫酸钙：1-5g/L。

4.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S2中，开始诱导时间：发酵培养至OD600达到15-20时，开始加入诱导剂；

诱导条件：加入诱导剂后反应器后异丙基-P-D-硫代半乳糖(TPTG)的终浓度为0.1-1mM/L，诱导温度为30℃-18℃。

5.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S2中，接种后至开始诱导培养时间为0-8h，开始后诱导时间为5-20h，放罐时OD600为50-120。

6.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S1或S2中，在平板挑单克隆，种子摇瓶培养及发酵罐诱导之前，培养温度为35-37℃。

7.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S3中，对菌体重新的重悬液选用PBS或者Tris-HCl缓冲液，pH调节至7.0-8.5。

8.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S3中，对菌体进行破碎的方式可采取以下方式：1)均质机破碎；2)超声破碎；3)溶菌酶裂解；

菌体破碎后的破碎液可采取以下类型离心机离心：1)管式离心机；2)碟式离心机；3)杯式离心机，确保离心力≥7000g。

9.根据权利要求1所述的一种全能核酸酶的高密度发酵表达及分离纯化的方法，其特征在于：步骤S4中，所选用的亲和层析填料均为螯合金属亲和层析填料，金属离子可为Cu2+，Ni2+，Zn2+，Co2+中任意一种，基质可为葡聚糖或琼脂糖的交联物。