[发明专利]基于RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs比色传感器检测GP73的方法

说明书

基于RGO‑CMCS‑Hemin/Pt@Pd NPs比色传感器检测GP73的方法，将氨基化的GP73适配体通过π‑π共轭及静电吸附作用与所得纳米材料结合，先形成RGO‑CMCS‑Hemin/Pt@Pd NPs‑GP73Apt识别探针，再形成AptΙ/GP73/RGO‑CMCS‑Hemin/Pt@Pd NPs‑GP73Apt夹心型复合结构；该复合结构催化Hsubgt;2/subgt;Osubgt;2/subgt;分解为Hsubgt;2/subgt;O和Osubgt;2/subgt;，进而将TMB氧化为oxTMB，使溶液由无色变为深蓝色，利用紫外‑分光光度计测量652nm处的紫外吸收峰，对比吸光度的差异，从而实现GP73的检测。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米材料结合适配体检测GP73的方法。

背景技术

目前高尔基体糖蛋白73（GP73）常用的检测方法主要是酶联免疫吸附测定（ELISA），利用抗原和抗体结合，通过滴加底物溶液发生显色反应，从而采用酶标仪进行定量测定。但此方法所用试剂盒造格昂贵，且所用抗体不易保存。公开号为CN 111378627 A的发明专利，涉及高尔基体蛋白73单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒及其在检测高尔基体蛋白73中的应用，但该方法耗时过长，且对抗体保存要求较高。公开号为CN 109254152 A的发明专利，公开了一种GP73抗体修饰纳米金，采用基于纳米金探针的酶联免疫吸附试验高灵敏检测GP73的方法，但该方法对操作环境和技术要求较高。因此，需要建立一种快速、灵敏、简单检测GP73的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素/纳米铂@钯纳米材料（RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs），构建夹心型比色传感器，实现GP73的可视化检测。

为解决该技术问题，首先通过分步还原法制备RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs纳米酶；其次利用π-π的共轭作用、静电吸附作用以及-NH₃与-COOH结合将氨基化的GP73适配体（Apt）结合到RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs表面作为识别探针；以未修饰GP73适配体（Apt Ι）为捕获探针；当有靶向GP73存在时，捕获探针和识别探针同时与GP73特异性结合，形成夹心型比色传感器。最后利用RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs的类过氧化物酶性质，催化H₂O₂分解为H₂O和O₂，进而将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化为氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（oxTMB），使溶液由无色变为深蓝色，利用紫外-分光光度计测量652 nm处的紫外吸收峰；对比吸光度的差异，从而实现对GP73的检测，最低检测限为5.0 ng/mL。

本发明按照以下步骤进行：

步骤1：RGO-CMCS-Hemin/Pt@Pd NPs-GP73Apt识别探针的制备

（1）还原性氧化石墨烯（RGO）的制备

称取氧化石墨烯（GO）置于纯水中，超声破碎，制成GO悬浮液，再加入抗坏血酸（AA）还原，得到RGO悬浮液；

（2）还原性氧化石墨烯-氯化血红素(RGO-Hemin)的制备

在氯化血红素（Hemin）粉末中加入氨水至纯水中溶解，得到氯化血红素溶液。在RGO溶液加入氯化血红素（Hemin），搅拌反应，得到均匀的RGO-Hemin分散液；

（3）还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-氯化血红素（RGO-CMCS-Hemin）的制备

在RGO-Hemin溶液中加入羧甲基壳聚糖（CMCS）溶液，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）活化，搅拌反应，得到RGO-CMCS-Hemin分散液；