[发明专利]一种牦牛前体脂肪细胞的制备方法

权利要求书

1.一种牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，取低日龄犊牦牛肾周和皮下脂肪组织，去除脂肪组织中可见的血管和结缔组织，加入加入胶原酶I培养基消化处理后，再加入生长培养基终止消化反应；

步骤2，反应产物过滤除未消化组织块和成团脂肪细胞后，细胞悬液离心除上清，再加入红细胞裂解液进行孵育处理，离心除上清，加入添加了细胞因子EGF和IGF1的生长培养基后进行培养；

步骤3，当牦牛前体脂肪细胞培养至密度达到 80%-90% 时对步骤2中获得的细胞清洗，加入胰酶溶液消化处理，再加入生长培养基终止消化反，加入添加了细胞因子EGF和IGF1的生长培养基后进行培养；

长培养基后进行培养；

步骤4，当培养瓶中细胞密度为 60%～70%时对步骤3中获得的细胞清洗，再使用添加了罗格列酮的诱导分化培养基进行培养，获得分化细胞。

2.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤1中，消化处理温度35-40℃，时间60～90 min。

3.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤1中，胶原酶I培养基的制备方法是：将50-500 mg胶原酶I溶解于50-200毫升D-Hanks液中，用2-8%NaHCO₃溶液调节PH值至7.2～7.4，过滤处理。

4.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤2中，离心处理过程转速1000-2000g/min，离心时间1-20min。

5.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤2中，红细胞裂解液的制备方法是：取KHCO₃ 5-30g、NH₄Cl 50-150g、Na₂EDTA 1-10g，溶于500-3000 mL双蒸水，配制成储存液，使用HCl或NaOH调节溶液pH值到7.2-7.4，过滤处理，并稀释后使用。

6.根据权利要求5所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，稀释倍数5-30倍。

7.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤3中，的胰酶溶液浓度0.05-0.5%。

8.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤1和步骤3中，生长培养基的制备方法是：将含有1-4% 双抗、5-15% FBS的DMEM/F12完全培养基，混匀后过滤除菌。

9.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤4中，罗格列酮在培养基中的浓度10-300nmol/L。

10.根据权利要求1所述的牦牛前体脂肪细胞的制备方法，其特征在于，步骤4中，添加了罗格列酮的诱导分化培养基的制备方法是：将含有5-25 μg/mL 胰岛素，0.5-4μmol/L 地塞米松，0.1-1 mmol/L IBMX ，50-300nmol /L罗格列酮的生长培养基混匀。