[发明专利]一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增检测方法

说明书

本发明提供了一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增检测方法，首先利用溶剂热法制备超顺磁性羧基化四氧化三铁磁珠，然后将热灭活的金黄色葡萄球菌作为免疫原获得了兔抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体，借助碳二亚胺法将二者相连，对偶联条件及磁珠抗体质量比进行优化以获得高性能免疫磁珠；其次，筛选重组酶聚合酶扩增技术最佳引物，检测其灵敏度、特异性，最终对免疫磁珠‑重组酶聚合酶扩增检测方法在人工污染样品及临床样品的应用效果进行评估。经充分验证，该检测方法具有高灵敏度、高特异性、简便快速的特点，是一种非常有效的畜产品中金黄色葡萄球菌的实时监测技术。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于免疫磁珠的金黄色葡萄球菌重组酶聚合酶扩增检测方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种常见的条件致病菌，危害人类和畜牧业的健康。其广泛分布于自然界中，如土壤内、空气中、皮肤表面、前鼻腔甚至胃肠道内，已发现几乎30％的人群是金黄色葡萄球菌的永久定植者^[1]。金黄色葡萄球菌不仅是引起食物中毒的主要病原菌之一，还是牛羊乳腺炎的主要致病菌之一。近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)在牛奶、乳制品和肉中不断检出^[2-5]，并开始出现与食物链相关和畜牧业相关的跨宿主流行现象^[6]。金黄色葡萄球菌对人和动物造成的危害愈发严重，对其预防、检测和控制等方面显得至关重要。目前常用的金黄色葡萄球菌检测方法有传统分离培养法、液相色谱法、ELISA、PCR方法，但存在耗时长、操作复杂、设备要求高、受样品基质影响大等缺点，这限制了对金葡菌进行现场快速检测的应用。

免疫磁分离技术的基本原理是借助偶联在磁珠表面的特异性抗体识别捕获目的抗原，在利用磁性纳米颗粒的超顺磁性从各种复杂的生物流体中分离富集出目的抗原。生物样品检测前的处理方式非常影响后续检测方法的灵敏度、特异性和时效性，典型的磁分离过程中，标记有抗体、适配体的磁珠能特异性结合到目标物(细胞、蛋白质、DNA、RNA、细菌、病毒)上，然后通过外部磁场的分离，使特定目标物从复杂基质中分离出来，达到富集浓缩的效果。现有的食品样品中微生物分离技术有传统分离培养法、低俗离心沉淀法、滤膜过滤法。传统分离培养仍为微生物检测的金标准，但该方法的最大缺点是过程繁琐，耗时长；低俗离心沉淀法则存在设备依赖性、灵敏度低的缺点；过滤法在用注射器推送食物样品、从滤器中抽取滤膜时较为费力。免疫磁珠(Immunomagnetic beads，IMBs)快速高效的富集分离作用在含少量目标物的待测样品预处理中具有很大的优势，即简便快速，灵敏度高，特异性强。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种能在等温下快速扩增目的片段的技术，最大的优势就是可在37-42℃下极快速扩增，仅10-20分钟即可观察结果，并且其扩增产物可用多种方式观察：琼脂糖凝胶电泳、实时定量荧光仪、侧流向试纸条。RPA既摆脱了传统PCR扩增变性、退火的复杂过程，又具有便捷、高灵敏度、特异性，是一种很有前途的快速检测病原菌的方法。与同为等温扩增技术的LAMP相比，RPA所需引物的设计更简单。经过近些年的快速发展，RPA已被广泛应用到各领域检测中，如病原菌检测、食品鉴定等。

[1]Kluytmans J,Van B A,Verbrugh H.Nasal carriage of Staphylococcusaureus:epidemiology,underlying mechanisms,and associated risks[J].ClinicalMicrobiology Reviews,1997,10(3):505-520.