[发明专利]一种纳米金检测凝血酶的方法

说明书

本发明公开了一种纳米金检测凝血酶的方法。该方法设计两种寡核苷酸序列，分别记为TB‑Apt1和TB‑cApt1，TB‑Apt1为凝血酶核酸适配体，TB‑cApt1为凝血酶核酸适配体的互补链。寡核苷酸分别通过多个腺嘌呤片段锚定在纳米金表面。TB‑Apt1与TB‑cApt1相互杂交，引起纳米金发生团聚。添加凝血酶后，TB‑Apt1与凝血酶结合，TB‑Apt1与TB‑cApt1形成的杂交链分离，纳米金由团聚状态变为分散状态。纳米金在溶液中分散状态的程度与凝血酶浓度成正相关关系。通过观察纳米金溶液吸收光光谱强度即可计算出凝血酶浓度。本发明通过使用腺嘌呤片段将寡核苷酸修饰在纳米金表面，降低了核酸功能化纳米金的成本，运用凝血酶诱导纳米金由团聚到解聚的过程实现凝血酶的低浓度检测，提高检测方法的灵敏度。

技术领域

本发明涉生物标志物检测技术领域，尤其设计蛋白质检测，具体为一种纳米金检测凝血酶的方法。

背景技术

凝血酶(Thrombin)作为一种凝血级联主要效应的丝氨酸蛋白酶，在生理和病理凝血中起着关键作用。凝血酶常被作为生物标志物，为疾病的早期发现和治疗提供依据，对凝血酶的高灵敏检测在临床诊断中具有重要意义。

纳米金由于具备灵敏的局域表面等离激元共振传感和易于合成、修饰的特点，常与核酸适配体联用用于开发比色检测方法。在此过程中，通常依靠靶标诱导纳米金团聚，通过观察纳米金溶液吸收光光谱变化来进行检测。但该方法检测灵敏度不够高，检测方法仍有改进空间。

发明内容

有鉴于此，本发明为了解决现有依靠纳米金团聚开展检测问题，提供一种依靠纳米金由团聚到解聚的凝血酶检测方法，可以方便、经济、高灵敏地检测凝血酶。

为达到上述目的，本发明包括寡合苷酸功能化纳米金的制备，包括如下步骤：

(1)TB-Apt1@AuNPs和TB-cApt1@AuNPs的制备

多个腺嘌呤片段的寡合苷酸功能化纳米金，用TB-Apt1和TB-cApt1先进行4000rpm的离心处理1min，再用TE缓冲液稀释至浓度为100μM的适配体稀释液，后分别进行震荡和离心处理三次，以保证适配体充分溶解于缓冲液中；

取25.6μL的TB-Apt1和TB-cApt1稀释液分别加入到2.2.3合成好的1.6mL浓度为8nM的纳米金胶体溶液中，充分混合后，保持轻微的搅拌状态，室温下持续24h。该适配体与纳米金的的摩尔比约为200：1，标记TB-Apt1@AuNPs(200:1)和TB-cApt1@AuNPs(200:1)；

向两个初步修饰适配体的纳米金溶液中先加入16μL浓度为500mM的Tris-acetate缓冲液，静置1h后再加入160μL浓度为1M的NaCl溶液(记住NaCl溶液可以分为几个批次加入，间隔1h，避免一次加入过多导致团聚)，最后静置48h(加入比例：每1mL混合液大约加入10μL的500mM的Tris-acetate缓冲液和100μL的1M的NaCl溶液)；

将静置后的TB-Apt1@AuNPs和TB-cApt1@AuNPs分别加入到超声清洗后的离心管中，16900g离心处理30min后去除上清液，再加入超纯水还原至原体积，再重复离心操作两次，最后一次用Tris缓冲液(Tris25mM，NaCl400mM，pH＝8.2)还原至原体积，多次离心操作以去除未修饰上适配体。

(2)TB-Apt1@AuNPs和TB-Apt1B@AuNPs杂交处理

将待使用的2mL离心管分别用乙醇和去离子水分别超声清洗5min；

取250μL，浓度是8nM的TB-Apt1@AuNPs和250μL，浓度是8nM TB-cApt1@AuNPs，分别加入到清洗后的离心管中，混合均匀后置于冰箱4℃环境静置，时间大于3小时。