[发明专利]一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法

说明书

本发明公开了一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，具体步骤包括：材料准备、成熟胚预处理消毒、胚性愈伤组织的诱导和愈伤组织的增殖。本发明以睡莲成熟胚为外植体，取材方便，经消毒处理后污染率低，愈伤组织诱导率高，增殖效果好，可用于遗传转化、种质资源保存与快繁生产，为睡莲再生体系、转基因研究建立基础。

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养技术，特别涉及一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法。

背景技术

睡莲（Nymphaea）是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)的多年生浮叶型水生草本植物，主要分布在温带及热带，其茎叶对水中富营养物和有害物质具有强吸附能力被广泛应用于园林水景中（廖卫伟，2016），市场需求广阔。目前睡莲品种中绝大多数还是通过人工杂交和自然杂交的手段结果的，育种周期长，随机性较强（李淑娟，2019），通过组织培养的方式生产种苗,生产速度快、可缩短繁育周期,有效保持种苗的优良性状并可以保存珍稀的睡莲种质资源，因此通过组织培养快速繁殖是目前尽快满足应用需求的有效途径，建立睡莲的无菌体系、离体再生体系迫在眉睫。

睡莲从淤泥水中长出，内生菌多，极易污染，离体培养过程中外植体灭菌和内生菌抑制的难度都较其它植物高，灭菌时间过短，会全部污染；灭菌时间过长则全部死亡（吴丽爽，2008），无菌材料的获得成为睡莲离体再生体系建立的技术瓶颈，这一技术难点若不加以有效解决，则很难进行商业化生产。

戚华沙等以蓝药睡莲的根状茎、根、叶片、叶柄及种子作为外植体，进行消毒试验研究，结果表明，采用根状茎及种子为材料消毒效果较好，并分别探索出了根状茎及种子的最佳消毒方法，但方法均建立在使用升汞消毒的前提下，现如今由于升汞的剧毒性，已被管制，需探究新的种子消毒试剂及方法；朱木兰等探究了一种睡莲无菌材料的制备方法，以睡莲种子为起始材料，经预处理、消毒、预培养等步骤，加快了种子萌发的时间，能快速获得睡莲无菌材料。但我们进行实验发现不同亚属睡莲的无菌苗获得需要使用不同的消毒方式，如热带睡莲九品香水莲的种子用常规的消毒方法较容易获得无菌苗，但不适用于雪白睡莲、‘曼拉’等多种耐寒睡莲的种子消毒，因此，需要进一步探索其有效的消毒方法。

目前，国内外也未见睡莲离体再生的成功报道，孙春青等以睡莲3个杂交组合的幼胚为外植体，研究出授粉后13～18d幼胚在1/2MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L培养基中诱导出睡莲愈伤组织，但愈伤组织增殖方面相关技术难题仍未攻克。

本发明主要目的就是为了解决睡莲组培难的问题，建立起睡莲稳定的无菌体系，通过成熟胚诱导胚性愈伤探索睡莲胚性愈伤组织诱导及增殖方法，为睡莲再生体系、转基因研究建立基础。此外，愈伤组织也可用于遗传转化、种质资源保存与快繁生产。

发明内容

本发明提供了一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其目的在于克服睡莲难消毒、愈伤难诱导难增殖的问题，建立睡莲稳定的无菌体系，为后续建立睡莲再生体系、遗传转化体系以及睡莲基因功能研究建立基础。

本发明的技术方案如下：

一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，包括以下步骤：

（1）取睡莲成熟胚置于流水下冲洗干净，再在多菌灵溶液中消毒后用蒸馏水冲洗至无多菌灵残余；

（2）准备愈伤组织诱导培养基；

（3）成熟胚消毒处理：

（a）将没有多菌灵残余的成熟胚装在离心管中，转移到超净工作台中；

（b）在超净工作台中对成熟胚进行消毒灭菌，先使用75%酒精消毒，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%次氯酸钠消毒，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的成熟胚放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干；

（c）将成熟胚坚硬种皮剥掉，取出成熟胚置于离心管中；