[发明专利]一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法

权利要求书

1.一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）成熟胚预处理：取睡莲成熟胚置于流水下冲洗干净，再在多菌灵溶液中消毒后用蒸馏水冲洗至无多菌灵残余；

（2）诱导培养基准备：准备愈伤组织诱导培养基；

（3）成熟胚的消毒处理：

（a）将没有多菌灵残余的成熟胚装在离心管中，转移到超净工作台中；

（b）在超净工作台中对成熟胚进行消毒灭菌，先使用75%酒精消毒处理1±0.1min，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%次氯酸钠消毒10±0.5min，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，处理后的成熟胚晾干；

（c）将成熟胚坚硬种皮剥掉，取出成熟胚置于离心管中；

（d）在超净工作台中，将去种皮成熟胚先用75%酒精消毒30±3s，消毒后用无菌水冲洗至无酒精残余，接着用3%次氯酸钠消毒3±0.3min，消毒后用无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的去种皮成熟胚晾干后接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养20-30天；

（4）准备愈伤继代培养基，其成分同步骤（2），将成熟胚从诱导培养基中转接入继代培养基，直到形成颗粒明显的愈伤组织；

（5）准备愈伤增殖培养基；

（6）增殖培养：待步骤（4）的愈伤组织直径长到4~8mm时，将其转移至愈伤增殖培养基中去，继续黑暗培养，从而获得大量胚性愈伤组织；

其中，所述睡莲为耐寒睡莲。

2.如权利要求1所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，选择饱满健康的睡莲成熟胚，将流水冲洗后的睡莲成熟胚放在10g/L多菌灵溶液中常温涡旋振荡消毒20±5min，用蒸馏水冲洗至多菌灵无残余。

3.如权利要求1或2所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，愈伤组织诱导培养基经配制得到，所述愈伤组织诱导培养基成分为：1/2MS+ 1.5~2.5 mg/L 2,4-D + 0.2~0.5 mg/L TDZ + 50g/L蔗糖 + 8g/L琼脂。

4.如权利要求3所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，愈伤组织诱导培养基配制时，称取1/2MS培养基、琼脂及蔗糖于容器中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素2,4-D 、细胞分裂素TDZ，调节pH为5.8±0.1，121℃灭菌20min。

5.如权利要求1或2所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，愈伤增殖培养基经配制得到，所述愈伤增殖培养基配方为MS + 2.0mg/L2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA + 30g/L蔗糖+ 6g/L琼脂。

6.如权利要求5所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，愈伤增殖培养基配制时，称取MS培养基、琼脂及蔗糖于容器中，加入1L蒸馏水加热溶解，再加入生长素、细胞分裂素6-BA，调节pH为5.8±0.1，121℃灭菌20min。

7.如权利要求1、2、4或6任一所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，当颗粒明显的愈伤组织直径长至6mm时，切去成熟胚只留愈伤组织，并将其转接到愈伤增殖培养基中；每隔25天更换一次培养基，获得胚性愈伤组织。

8.如权利要求1所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养和愈伤增殖培养全过程均置于黑暗条件下，其培养环境温度控制在26℃。

9.如权利要求1所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（b）中，先使用75%的酒精处理1min，无菌水冲洗至无酒精残余，接着用10%的次氯酸钠溶液处理10min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，将处理后的成熟胚放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干。

10.如权利要求1或9所述的一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法，其特征在于，所述步骤（d）中，在超净工作台中用75%酒精处理去种皮成熟胚30s，无菌水冲洗至无酒精残余，再用3%次氯酸钠处理3min，无菌水冲洗至无次氯酸钠残余，放在经高温灭菌烘干后的滤纸上晾干，接入愈伤组织诱导培养基中，置于26±1℃条件下黑暗培养20-30天。