[发明专利]一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明提供一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒，其包括如下步骤：（1）将第一肽底物、第二肽底物与转肽酶A标准品或待测样品分别混合孵育形成肽复合物；第一肽底物和第二肽底物的质量比为10~150:1；（2）使肽复合物附着在支持物上；（3）加入能够与生物素结合并能够催化底物显色的酶的复合物以及显色底物，检测反应体系发出的信号值，并根据转肽酶A标准品的检测结果评估待测样品的酶活性。本发明的方法可以同时反映转肽酶实际工艺应用过程中的水解和偶联功能，并且检测灵敏度高，具有更低的定量下限，其检测成本低、通量高、操作简单。

技术领域

本发明属于生物分析、免疫检测、酶活检测领域，具体涉及一种转肽酶活性的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

在日趋火热的生物靶向药物领域，抗体偶联药物（Antibody Drug Conjugates，ADC）因其独特的结构特征、高效低毒的疗效而备受关注，然而ADC药物的成功离不开偶联技术的进步。传统化学偶联技术在ADC偶联过程中存在着制备工艺复杂、对蛋白质活性有损伤、连接产物不均一等问题，而基于转肽酶（Sortase）介导的ADC偶联技术可以很好地克服传统化学连接法的一系列问题，并具有反应条件温和、反应效率高、底物适用性广等明显优势，代表了蛋白质连接技术的发展新趋势。

现阶段用于合成或生产特异性标记蛋白、抗体产品的转肽酶越来越多。由于转肽酶制备工艺复杂、批间质量控制难度较高，所以一个可靠、健全的检测转肽酶活性的方法显得尤为重要。目前市面上有一些针对转肽酶A的检测试剂盒，如阿纳斯派克（AnaSpec）公司采用5-FAM/QXL^® FRET（5-FAM-LPXTG）为底物，转肽酶A水解该底物后释放FRET荧光基团，捕获荧光信号。Ryan G. Kruger等人设计了Dabcyl-QALPETGEE-Edans作为底物，转肽酶水解后应用HPLC进行信号检测。

现有的检测方法都仅用于检测转肽酶 A的水解功能，而应用于偶联技术的转肽酶A包含水解和偶联两个功能，水解和偶联的主要功能位点也是分开的；转肽酶A的水解反应速率要远远慢于其偶联速率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够同时反映转肽酶水解和偶联活性的检测方法及检测试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明第一方面提供一种转肽酶活性的检测方法，其包括如下步骤：

（1）将第一肽底物、第二肽底物与转肽酶A标准品或待测样品分别混合孵育形成肽复合物；其中，所述第一肽底物和所述第二肽底物的质量比为10~150:1；

所述第一肽底物的结构式如式（I）所示：

；

所述第二肽底物的结构式如式（II）所示：

；

（2）通过所述肽复合物上的His标签与支持物上的His标签抗体结合，使所述肽复合物附着在所述支持物上；

（3）向步骤（2）的反应体系中加入能够与生物素结合并能够催化底物显色的酶的复合物以及显色底物，检测反应体系发出的信号值，并根据所述转肽酶A标准品的检测结果评估所述待测样品的酶活性。

在一些实施方案中，所述能够与生物素结合并能够催化底物显色的酶的复合物为偶联酶的亲和素。在一些实施方案中，亲和素为链霉亲和素。在一些实施方案中，能够催化底物发出信号的酶为辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）或葡萄糖氧化酶。

本申请不再仅局限于检测转肽酶的水解活性，本申请通过两个肽底物形成的复合物带有的信号标记物并结合信号值检测法建立转肽酶活力检测方法，该方法完全模拟了转肽酶在ADC工业应用中的作用与功能：同时反映转肽酶实际工艺应用过程中的水解和偶联功能。