[发明专利]一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用

说明书

本发明提供了一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用。所述的快速长片段扩增酶为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的DNA聚合酶，所述的修饰的DNA聚合酶与未修饰的DNA聚合酶的氨基酸序列相比，进行如下突变：第145位的亮氨酸L突变为谷氨酰胺Q，第719位的缬氨酸V突变为天冬酰胺N，所述快速长片段扩增酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 48所示。本发明具有如下技术效果：1）本发明的DNA聚合酶为经氨基酸序列修饰的可快速扩增长片段的DNA聚合酶，能够实现对长片段目的序列的快速准确扩增；可在一个PCR反应实现对KIR亚型基因的全长扩增，长至16kb；2）能够实现对样本KIR基因的快速扩增及测序分型。

技术领域

本发明涉及一种快速长片段扩增酶及其在KIR基因测序中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)来源于骨髓淋巴样干细胞，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。NK细胞主要分布于外周血和脾，在淋巴结和其他组织中也有少量存在。NK细胞不表达特异性抗原识别受体，是不同于T、B淋巴细胞的一类淋巴样细胞。NK细胞可表达多种表面标志，其中多数也可表达于其他免疫细胞表面。NK细胞属于非特异性免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。NK细胞能够杀伤某些病毒感染的细胞和突变的肿瘤细胞，而对宿主正常组织细胞下不具细胞毒作用，表明NK细胞具有识别宿主自身正常组织细胞和体内异常组织细胞的能力。近年来研究证实，NK细胞表面具有两类功能截然不同的受体，其中一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可激发NK细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞活化受体；另一类受体与靶细胞表面相应配体结合后，可抑制NK细胞产生杀伤作用，称为杀伤细胞抑制受体。NK细胞识别HLA I类分子的受体由两种结构不同的家族分子构成。一种称之为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killerimmunoglobulin-like receptor,KIR)；另一种称之为杀伤细胞凝集素样受体(killerlectin-like receptor,KLR)。

KIR(killer immunoglobulin-like receptor,KIR)是位于NK细胞和某些T细胞表面表达的一组特异性识别人类主要组织相容性抗原MHCⅠ类分子的受体，对NK细胞效应功能的发挥起重要免疫调节作用。KIR位于人类19q13.4，白细胞受体复合物(LRC)上，跨距约150kb、头尾排列，聚集成簇和多态性丰富的多基因家族所编码，基因呈不规律排列，其结构和功能具有多样性。Uhrberg等首次采用PCR-SSP方法对KIR进行基因分型，显示了在不同NK细胞克隆含有不同数目和种类的KIR基因。由于KIR基因分型方法的不断改进和完善，KIR基因家族成员的不断扩增，先前忽略的基因，假基因和变体不断浮出水面，Katharine等证实通过家系分离和基因组测序和基因序列的确定，单凭基因含量就超过20多种KIR单倍型和至少40-50种KIR基因型，目前在低分辨水平上可检测的有18个KIR基因型，即KIR1D、KIR2D1-5、KIR2DS1-5、KIR3DL1-3、KIR3DS1、假基因Xv、X和KIR2DP1，这些基因表现出不同程度的多态性。在Uhrberg、Norman和Gomez-Lozano等人的工作基础上，其他研究工作者通过重新调整合成多对引物优化KIR分型的正确性。