[发明专利]长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用

说明书

本发明公开了一种长牡蛎β‑tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用，属于基因编辑技术领域。本发明的长牡蛎β‑tubulin基因的电穿孔基因编辑方法是在长牡蛎受精卵出现第一极体10min内完成电穿孔实验，对长牡蛎β‑tubulin基因进行电穿孔基因编辑；其中，电穿孔实验体系中sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL；电穿孔实验参数为40V/50ms。在该条件下，能够获得长牡蛎β‑tubulin基因的高编辑效率和幼虫的高存活率，并且可以降低sgRNA和Cas9蛋白使用量；降低时间成本和人力成本。

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用。

背景技术

牡蛎隶属双壳纲，软体动物门，营固着生活，滤食，在全世界各地沿海地区都有分布。牡蛎作为全世界重要的水产养殖经济贝类，肉质鲜美，营养丰富，而且具有一定的药用价值和保健功能。长牡蛎(Crassostrea gigas)目前是我国主要的经济贝类养殖种类。

基因编辑技术是揭示基因功能最有效的方法，目前基因编辑技术在基因功能研究中已经得到广泛应用，应用最为广泛的是CRISPR/Cas9基因编辑技术，即规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)。作为一种基因编辑工具，CRISPR系统能够定点修饰基因组，与TALENs、ZFNs基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9基因编辑技术因具有操作简单、靶点选择广、成本低和效率高等优点，CRISPR系统已被广泛应用于药物研制、疾病治疗、动物模型和生物遗传育种等方面。

目前CRISPR/Cas9基因编辑技术主要借助显微注射或者电穿孔方法等将sgRNA和Cas9导入受精卵。显微注射技术，通量比较小，较为费时费力。电穿孔方法有通量大、省时省力的优点。目前海洋经济贝类基因编辑技术仍然发展较为缓慢，有几例报道仅见于胚胎操作较易的腹足类，双壳类仅有两例基因编辑报道。牡蛎受精卵大小在40μm左右，相比于显微注射导入外源物质，选用电穿孔方法进行CRISPR/Cas9基因编辑更高效。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明要解决并优化牡蛎中电穿孔CRISPR/Cas9基因编辑技术，找到最优参数实现高存活率，高编辑效率；调整sgRNA和Cas9蛋白用量，降低目前电穿孔方法的sgRNA和Cas9蛋白使用量；电穿孔方法的优化，降低时间成本和人力成本；提供了β-tubulin基因作为经济贝类基因编辑体系构建标记基因的先例。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，步骤如下：

筛选长牡蛎亲贝，解剖获取卵子和精子，在26℃海水中进行人工授精，精卵比例为3-5:1；授精完成后，观察第一极体出现时间，出现第一极体10min内完成电穿孔实验，对长牡蛎β-tubulin基因进行电穿孔基因编辑；电穿孔实验后的受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养；将电穿孔基因编辑处理后的受精卵培育至8h-11h，取样进行基因型和表型突变的检测；

其中，100μL电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μL，sgRNA和Cas9蛋白复合物10μL，受精卵30μL；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为15-45ng/μL；受精卵的浓度为1000个/μL；

电穿孔实验参数为36-250V/0.1-50ms。

在一个具体的实施例中，所述电穿孔实验参数为36V/10ms；40V/10ms；40V/40ms；40V/50ms；60V/40ms；70V/20ms；80V/25ms；80V/30ms；90V/22ms；200V/0.3ms；250V/0.1ms；优选的为40V/50ms。