[发明专利]长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法及应用有效
| 申请号： | 202210378335.1 | 申请日： | 2022-04-12 |
| 公开（公告）号： | CN114703231B | 公开（公告）日： | 2023-10-24 |
| 发明（设计）人： | 张琳琳;张韦;许悦;产久林 | 申请（专利权）人： | 中国科学院海洋研究所 |
| 主分类号： | C12N15/87 | 分类号： | C12N15/87;C12N15/12 |
| 代理公司： | 山东三邦知识产权代理事务所(普通合伙) 37308 | 代理人： | 牛继梅;高洋 |
| 地址： | 266071 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 牡蛎 tubulin 基因 穿孔 编辑 方法 应用 | ||
1.一种长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：
筛选长牡蛎亲贝，解剖获取卵子和精子，在26℃海水中进行人工授精，精卵比例为3-5:1；授精完成后，观察第一极体出现时间，出现第一极体10min内完成电穿孔实验，对长牡蛎β-tubulin基因进行电穿孔基因编辑；电穿孔实验后的受精卵放入天然海水中，26℃恒温培养；将电穿孔基因编辑处理后的受精卵培育至8h-11h，取样进行基因型和表型突变的检测；
其中，100μL电穿孔实验体系包含电转缓冲液60μL，sgRNA和Cas9蛋白复合物10μL，受精卵30μL；电转缓冲液为使用天然海水配制的0.77M甘露醇溶液；sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为15-45ng/μL；受精卵的浓度为1000个/μL；
电穿孔实验参数为36-250V/0.1-50ms。
2.根据权利要求1所述长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，所述电穿孔实验参数优选的为40V/50ms。
3.根据权利要求1所述长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，所述sgRNA和Cas9蛋白复合物中sgRNA与Cas9蛋白终浓度为30ng/μL。
4.根据权利要求1-3任一项所述长牡蛎β-tubulin基因的电穿孔基因编辑方法，其特征在于，所述sgRNA和Cas9蛋白复合物由以下方法获得：
(1)根据SEQ ID NO:1所示的长牡蛎β-tubulin基因的核酸序列，设计长牡蛎β-tubulin基因的两个sgRNA位点，靶位点分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
(2)针对上述两个靶位点，依据sgRNA引物设计原则，设计长牡蛎β-tubulin基因sgRNA引物分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
(3)使用特异性引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5与通用引物合成sgRNAs的DNA模板；进行体外转录获得长牡蛎β-tubulin基因的sgRNA1和sgRNA2；
(4)将sgRNA1、sgRNA2和Cas9蛋白按照浓度配比为1:1:1混合制得sgRNA和Cas9蛋白复合物。
5.β-tubulin基因作为经济贝类基因编辑体系构建中的标记基因的应用。
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