[发明专利]用于延长蛋白质半衰期的方法

说明书

本发明涉及一种通过替换蛋白质一个或更多个氨基酸残基延长蛋白质或(多)肽半衰期的方法。进一步地，本发明关于通过上述方法制备的具有延长的半衰期的蛋白质。

本申请是申请日为2016年10月30日，申请号为201680071485.0，发明名称为“用于延长蛋白质半衰期的方法”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种通过替换蛋白质的与泛素化相关的一个或更多个赖氨酸残基来延长蛋白质或(多)肽半衰期的方法，且涉及具有延长的半衰期的蛋白质。

背景技术

真核细胞中的蛋白质或(多)肽通过溶酶体系统和泛素-蛋白酶体系统两种不同途径被降解。分解10-20％的细胞蛋白的溶酶体系统，即没有底物特异性也没有精密时序可控性。也就是说，溶酶体系统是一种尤其分解大多数细胞外蛋白或膜蛋白的过程，例如表面蛋白通过内吞作用被细胞摄取，再被溶酶体降解。至于真核细胞中蛋白质的选择性降解，应涉及泛素-蛋白酶体途径(UPP)，在这之中，目标蛋白首先结合泛素结合酶以形成多聚泛素链，再被蛋白酶体识别并分解。大约80-90％的真核细胞蛋白是通过UPP降解的，因此，UPP被认为调控真核细胞内大部分蛋白的降解，且负责体内的蛋白质转换和体内稳态。泛素是一个由76个高度保守的氨基酸组成的小蛋白，且它存在于所有真核细胞中。在泛素的所有氨基酸残基中，第6、11、27、29、33、48和63位残基是赖氨酸(Lysine,Lys,K)，且已知第48位和63位的残基对多聚泛素链的形成起关键作用。通常称为E1、E2、E3的三种酶连续作用以促进泛素化，而被泛素标记的蛋白则被ATP依赖的蛋白质降解复合物中的26S蛋白酶体分解。

如上所述，泛素蛋白酶体途径(UPP)由两个分离且连续的过程组成。一个过程是一定数目的泛素分子连接至底物蛋白的蛋白标记过程，而另外一个则是经标记的蛋白被26S蛋白酶体复合物降解的过程。泛素和底物蛋白之间的结合是通过泛素C末端的甘氨酸残基和底物的赖氨酸残基之间形成异肽键，然后再通过一系列酶(泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3)在泛素和底物蛋白之间形成硫脂键而实施的。已知E1(泛素激活酶)通过ATP依赖的反应机制激活泛素。被激活的泛素被转移至E2(泛素结合酶)的泛素结合域中的半胱氨酸残基上，然后E2运送被激活的的泛素到E3连接酶处或直接运送至底物蛋白处。E3同样催化底物蛋白的赖氨酸残基和泛素的甘氨酸残基之间形成异肽键。另外一个泛素能够被连接至与底物蛋白相连的泛素的C末端的赖氨酸残基上，额外的泛素部分的重复连接通过一定数目的泛素分子彼此相连而产生多聚泛素链。当多聚泛素链被生成之后，底物蛋白则被26S蛋白酶体选择性地识别并降解。

与此同时，生物体内有着多种具有治疗效果的蛋白质。这些在体内具有治疗效果的蛋白质或(多)肽或生物活性多肽包括，但不限于，例如，生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素(干扰素-α或干扰素-β)、干扰素受体、集落刺激因子(CSF)、胰高血糖素样肽、白介素、白介素受体、酵素、白介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、G蛋白偶联受体、人生长激素(hGH)、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、过敏抑制剂、细胞坏死糖蛋白、G蛋白偶联受体、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白E、红细胞生成素、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、第七因子、第七因子a、第八因子、第九因子、第十三因子、纤维蛋白溶酶原激活因子、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原蛋白酶抑制剂、过氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板源生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降血钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、纤维蛋白结合肽、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子通道抑制剂、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺素、松弛肽、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、肠促胰酶肽、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。