[发明专利]一种基于MBTH法测定肺炎球菌活化糖中还原糖含量的方法、试剂和试剂盒

说明书

本申请涉及物质检测技术领域，具体公开了一种基于MBTH法测定肺炎球菌活化糖中还原糖含量的方法、试剂和试剂盒。所述方法包括如下步骤：(1)建立线性回归方程；(2)测定还原糖含量：用水将待测样品稀释，得到待测样品溶液；以水作为空白对照，并在波长650nm处测定经过预处理后的待测样品溶液的吸光度；根据步骤(1)所得到的线性回归方程，计算出所述待测样品溶液的吸光度在标准曲线上所对应横坐标的浓度；待测样品中还原糖的浓度=待测样品溶液的浓度×待测样品的稀释倍数。所述试剂包括盐酸溶液、MBTH水溶液、三氯化铁水溶液。所述试剂盒，包括上述试剂。本申请提高了测定还原糖的灵敏度。

技术领域

本申请涉及物质检测技术领域，具体涉及一种基于MBTH法测定肺炎球菌活化糖中还原糖含量的方法、试剂和试剂盒。

背景技术

肺炎链球菌是一种重要的人类病原菌，可引起肺炎、脑膜炎、菌血症和中耳炎等侵袭性疾病，婴幼儿和老年人是其主要的易感人群，全球每年约有70～100万的5岁以下儿童死于肺炎链球菌引起的疾病。肺炎链球菌最主要的毒力因子是荚膜多糖。多糖是非T细胞依赖性抗原，而2岁以下儿童的免疫系统尚未发育完全，缺乏对T细胞非依赖性抗原发生免疫应答的能力。更严重的是致病性肺炎球菌感染的发病率在2岁以下儿童最高。但将荚膜多糖与载体蛋白共价结合形成的结合疫苗可以使多糖由T细胞非依赖型抗原转变为T细胞依赖型抗原，并能在婴幼儿体内产生良好的免疫原性及长久的保护力。

多糖抗原与蛋白抗原之间的结合，是利用多糖和蛋白分子中存在的羧基、半缩醛、氨基/亚氨基、巯基/二硫键、羟基等功能基通过共价结合进行的。而这种共价结合需先将多糖进行活化，国内外采用的活化剂有NaIO₄、CNBr和CDAP，其中利用高碘酸钠氧化多糖分子上的领位羟基转化成醛基或酮基与蛋白质中的氨基反应形成Schiff碱，所形成的Schiff碱在还原剂(如氰基硼氢化钠)的作用下可还原成稳定的糖蛋白偶联物，这种结合方式为还原胺化法。另一种是氰基化作用，其原理是利用溴化氰或1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)为活化剂，其在碱性条件下用CNBr或CDAP活化多糖分子上的羟基形成氰酸酯，然后与己二酰肼(ADH)反应将酯酰肼(AH)基团导入多糖分子形成PS-AH衍生物，最后在碳二亚胺的介导下与蛋白载体形成稳定的结合物。

肺炎球菌多糖结合物结合工艺中采用胺还原法进行制备，其中最为关键的一步就是高碘酸钠氧化多糖，在氧化的过程中如果没有控制好实验条件，就会发生过氧化的现象，导致羟基氧化成羧基，随后在结合蛋白的时候就会出现下降的结合，另外有研究表明随着氧化度的增加，氧化对多糖结构破坏更剧烈，且对多糖抗原性破坏更大，所以应控制多糖氧化度在一定的范围。基于高碘酸钠将多糖氧化成醛基或酮基，因此对其中还原糖含量的测定可以反应多糖的氧化程度。

测定还原糖的方法主要有3,5-二硝基水杨酸(DNS)法、铁氰化钾法和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物(MBTH)法，上述三种测定方法的精密度和回收率相近，但是MBTH法测定还原糖的灵敏度最高。

但是，在相关报道中，MBTH法以木糖为对照品，对照品溶液浓度为50μg/ml的木糖溶液；具体测定法为精确移取0、50、100、150、200、250、300、350μl木糖对照品溶液，用蒸馏水补至600μl，各加入0.5mol/L的NaOH溶液600μl和MBTH试剂(3mg/ml的MBTH溶液和1mg/ml的DTT溶液等量混合即得)600μl，80℃水浴加热15min后趁热加入硫酸铁铵试剂(0.5wt％[FeNH₄(SO₄)₂]·12H₂O，0.5wt％氨基磺酸，0.5mol/L盐酸)1.2ml，混匀，室温冷却后在650nm处测定吸光度。该方法测木糖的检测限为0.3μg/ml(换算成醛基的检测限浓度为1.998nmol/ml)。

发明内容

为了提高测定还原糖的灵敏度，本申请提供一种基于MBTH法测定肺炎球菌活化糖中还原糖含量的方法、试剂和试剂盒。