[发明专利]一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法

说明书

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌YH‑18高效产孢的工业化发酵方法，属于生物发酵技术领域。本发明通过单因素分析和响应面优化分析得到实验室优化培养基，并在其基础上进行改良筛选得到贝莱斯芽孢杆菌YH‑18高效产孢的工业化发酵培养基：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙和0.02％硫酸锰，然后将其进行发酵工艺验证，发现使用本发明的工业化发酵培养基得到的发酵液抑制根癌农杆菌C58生长的能力增强，且通过产品货架期的探索，表明YH‑18液体制剂在4℃环境下至少能保存一年以上，芽孢率高，更耐存储。

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢及提高贝莱斯芽孢杆菌YH-18发酵液抗菌能力的工业化发酵方法。

背景技术

贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)是由Ruiz等人于2005年提出的新种(Ruiz-garcía,2005)，其分类地位曾与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)归为一起；2008年Wang等(Wang et al,2008)人通过基因组同源性比对后认为贝莱斯芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌应为同种不同名；在2015年和2016年，Dunlap等(Dunlap et al,2015)人先后通过全基因组序列分析得出，解淀粉芽孢杆菌亚种植物专化型(B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum)与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)为同种，并最终确定了甲基营养型芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌植物转化型，贝莱斯芽孢杆菌属于同物异名。而B.velezensis在国内的译名为瓦雷兹芽孢杆菌或贝莱斯芽孢杆菌。

贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)是一类有良好应用价值的芽孢杆菌，其分泌的酶、抗生素或抗菌蛋白等活性物质能够广泛的抑制植物病原真菌和细菌的活性，减少植物病害；且具有解磷、解钾、固氮，产生植物生长因子等作用，从而促进植物养分吸收。因此，研究开发具有促生抗病作用的贝莱斯芽孢杆菌具有广阔应用前景。

贝莱斯芽孢杆菌YH-18(B.velezensis YH-18)是从樱花枝干中分离出来的一株具有固氮、耐盐、解磷、可提高植物抗性和促生增产的有益微生物，能有效地预防樱花、桃树、葡萄等植物的根癌病(江明明,2016；魏丹萍,2020)。

但是目前许多实验室筛选得到的具有优良促生抗病作用的菌株，对于其发酵工艺还仅仅停留在实验室水平，若想将实验室菌株大范围推广运用，必须建立起菌株的工业化发酵工艺，因此建立一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢及提高贝莱斯芽孢杆菌YH-18发酵液抗菌能力的工业化发酵方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵方法，包括以下步骤：

1)采用以下重量百分比的原料配制贝莱斯芽孢杆菌YH-18高效产孢的工业化发酵培养基：0.5％葡萄糖、2％玉米淀粉、1％玉米浆干粉、0.5％鱼粉蛋白胨、0.1％硫酸铵、0.1％硫酸镁、0.1％磷酸氢二钾、0.2％碳酸钙和0.02％硫酸锰；

2)挑取LB平板上贝莱斯芽孢杆菌YH-18单菌落至含LB培养基摇瓶中，恒温震荡条件下进行活化培养，得到一级种子液；

3)将一级种子液以1％接菌量接入LB培养基摇瓶中，恒温震荡条件下进行培养，得到二级种子液；

4)将二级种子液接种至发酵罐，分别依照200L、5000L的一级、二级发酵罐规模进行逐级扩大发酵培养，待发酵液中芽孢率达到95％后停罐。